Automatización de la generación de iPSC para permitir la terapia de reemplazo de células fotorreceptoras autólogas

Journal of Translational Medicine volumen 21, número de artículo: 161 (2023) Citar este artículo

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La degeneración hereditaria de la retina es una de las principales causas de pérdida incurable de la visión en el mundo desarrollado. Si bien el reemplazo de células fotorreceptoras autólogas mediado por iPSC es teóricamente posible, la falta de tecnologías disponibles comercialmente diseñadas para permitir la producción paralela de alto rendimiento de terapias específicas para pacientes ha obstaculizado la traducción clínica.

En este estudio, describimos el uso de la plataforma de cultivo celular robótico de precisión Cell X para permitir la producción paralela de iPSC de grado clínico específicas para pacientes. La Celda X está alojada dentro de un aislador aséptico cerrado que cumple con ISO Clase 5 cGMP (Biospherix XVivo X2), donde se realizaron todos los procedimientos, desde el cultivo de fibroblastos hasta la generación de iPSC, la expansión clonal y la diferenciación de retina.

Se determinó que las iPSC de pacientes generadas utilizando la plataforma Cell X eran pluripotentes mediante un análisis de tarjeta de puntuación y genéticamente estables mediante cariotipo. Según lo determinado mediante inmunotinción y microscopía confocal, las iPSC generadas utilizando la plataforma Cell X dieron lugar a organoides retinianos que eran indistinguibles de los organoides derivados de iPSC generadas manualmente. Además, 120 días después de la diferenciación, el análisis de secuenciación de ARN unicelular reveló que las células generadas utilizando la plataforma Cell X eran comparables a las generadas en condiciones manuales en un laboratorio separado.

Hemos desarrollado con éxito una plataforma robótica de generación de iPSC y procedimientos operativos estándar para la producción de células precursoras de fotorreceptores de alta calidad que son compatibles con las buenas prácticas de fabricación actuales. Este sistema permitirá la producción de iPSC de grado clínico para el reemplazo autólogo de células retinianas.

Desde el primer trasplante de riñón exitoso entre gemelos idénticos en 1954 [1], el campo de la medicina regenerativa ha florecido. El trasplante de órganos sólidos compatibles con HLA es ahora algo común y salva miles de vidas cada año [2, 3]. El éxito del trasplante de órganos sólidos puede atribuirse en parte al hecho de que el tejido permanece viable durante un período prolongado después de la recolección y a que es posible restablecer conexiones funcionales con el huésped mediante una combinación de microcirugía y sistema nervioso periférico (SNP). reinervación. A diferencia de los órganos periféricos, los tejidos maduros del sistema nervioso central (SNC) no gozan de las mismas ventajas. Específicamente, los tejidos del SNC sufren daños irreversibles minutos después de que se pierde la perfusión. Además, debido a las propiedades intrínsecas tanto ambientales como celulares, la capacidad de regeneración de las neuronas maduras del SNC es limitada. Por ejemplo, después de un trasplante subretiniano en ratones con retina degenerativa, las láminas intactas de células fotorreceptoras maduras no logran extender los axones ni establecer conexiones sinápticas con las interneuronas de la retina del huésped [4]. Por el contrario, las células progenitoras de la retina en desarrollo pueden integrarse fácilmente con la retina distrófica del huésped después del trasplante [5]. Por esta razón, nosotros y otros hemos centrado nuestra atención en desarrollar estrategias de reemplazo de células fotorreceptoras basadas en células madre para el tratamiento de pacientes con ceguera degenerativa de la retina [6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23].

Si bien las células progenitoras de retina y precursoras de fotorreceptores posmitóticos se encuentran en una etapa apropiada de desarrollo para el trasplante de retina [5, 24,25,26,27], estas células solo pueden recolectarse de la retina de un donante fetal en etapa tardía, lo que las hace éticamente desfavorables y difíciles. obtenerse en cantidades suficientes para que sean clínicamente viables. En lugar de aislar las células progenitoras de la retina de un feto en desarrollo, este campo ha centrado gran parte de su atención en el desarrollo de protocolos diseñados para guiar la diferenciación de células madre pluripotentes en los tipos de células deseados [28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44].

Se han utilizado células madre embrionarias (ESC) y pluripotentes inducidas (iPSC) para generar células progenitoras de retina y precursoras de fotorreceptores trasplantables [8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 20, 21, 44]. Si bien las ESC no están exentas de debate ético, los Institutos Nacionales de Salud han mantenido un registro de líneas celulares ES establecidas que son aceptables para su uso en trabajos financiados por los NIH [45]. Estas líneas han sido completamente caracterizadas y están disponibles para su distribución. La ventaja de utilizar una única línea ESC para el reemplazo clínico de células es que se puede crear un banco de células maestras validado de progenie trasplantable utilizando enfoques de fabricación a gran escala fácilmente disponibles. Un inconveniente asociado con este enfoque es que el donante y el receptor son genéticamente discordantes (es decir, alogénicos). Para garantizar la longevidad del aloinjerto, probablemente será necesaria una supresión inmunitaria de por vida.

A diferencia de las células ES, las iPSC pueden generarse a partir del paciente que las necesita (es decir, autólogas), lo que reduce en gran medida la posibilidad de rechazo inmunológico y la necesidad de supresión inmune de por vida después del trasplante [46, 47]. Desafortunadamente, las estrategias de fabricación actuales, que están diseñadas principalmente para la fabricación a gran escala de un solo producto, no son adecuadas para la producción de terapias celulares autólogas. El reemplazo de células fotorreceptoras autólogas requerirá la producción de iPSC derivadas de pacientes y la derivación de células progenitoras de la retina de docenas de individuos en paralelo. Si bien esto podría hacerse simplemente agregando personal técnico, cada uno de los cuales sea responsable de generar una pequeña cantidad de líneas celulares según las buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP), esta estrategia aumentaría drásticamente los costos de producción y daría como resultado una mayor variabilidad del producto. Para abordar estos problemas, se necesitan plataformas robóticas que puedan automatizar los pasos que requieren mucha mano de obra para la fabricación terapéutica basada en iPSC.

En este manuscrito describimos la generación exitosa de iPSC específicas para pacientes de grado clínico utilizando la plataforma robótica de precisión Cell X ™ [48]. Esta plataforma fue diseñada para realizar muchos de los pasos críticos asociados con la producción de líneas celulares autólogas, incluidas imágenes, intercambio de medios, recolección, deshierbe y expansión clonal de iPSC. Al colocar la plataforma Cell X dentro de un sistema Biospherix Xvivo que cumple con cGMP, hemos podido generar de manera confiable iPSC de pacientes de alta calidad que conservan un cariotipo normal, son pluripotentes y pueden diferenciarse en organoides retinianos que contienen células progenitoras de retina y precursoras de fotorreceptores trasplantables. . Se descubrió que la progenie resultante derivada de iPSC era indistinguible de la generada mediante procesamiento manual. En resumen, la incorporación de la plataforma Cell X en una línea de producción clínica de iPSC mejorará en gran medida el rendimiento de fabricación, permitirá la rastreabilidad del producto y reducirá la variación entre lotes asociada con la deriva del protocolo, las diferencias entre el personal técnico y el error humano.

La reprogramación, la expansión clonal y la diferenciación de la retina se realizaron utilizando la plataforma Cell X™ (Cell X Technologies Inc, Cleveland, OH), que está contenida dentro de un sistema Biospherix Xvivo compatible con cGMP (BioSpherix, Ltd., Parish, NY) utilizando cGMP. reactivos compatibles. Los fibroblastos dérmicos aislados de biopsias de piel obtenidas de pacientes con ceguera degenerativa retiniana hereditaria se reprogramaron utilizando el kit CytoTune2 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), un kit de reprogramación viral Sendai no integrador, como se informó anteriormente [49]. Brevemente, fibroblastos aislados de una biopsia dérmica por punción de 3 mm y cultivados a 37 °C y 5% de CO2 y 20% de O2 en medios de biopsia [49]. Para mantener la coherencia, el lunes se transducen 250.000 fibroblastos en un pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos con una MOI objetivo de 5 con vectores virales Sendai que impulsan la expresión de OCT4, SOX2, KLF4 y C-MYC. Los medios de reprogramación viral se reemplazan el martes y los cultivos se alimentan posteriormente (es decir, se cambiaron los medios) el miércoles. El viernes, 4 días después de la transducción, las células se pasaron a una placa de cultivo recubierta con laminina 521 (LN521, BioLamina, Sundbyberg, Suecia) de 6 pocillos a 5.000, 10.000 y 20.000 células por pocillo (es decir, 3 pocillos separados). A las 24 h después del pase, el medio se cambió a medio Essential 8 (E8) completo (CTS, Thermo Fisher Scientific) y la tensión de oxígeno se redujo al 10%, donde se mantuvo hasta después de la recolección de colonias. Cada vez que se alimentó el cultivo (es decir, todos los lunes, miércoles y viernes), se escaneó toda la superficie de la placa de cultivo utilizando la plataforma Cell X™, que permite el seguimiento de las células desde el aislamiento de fibroblastos hasta el crecimiento, la selección y la clonación. expansión de las iPSC. Una vez que las colonias alcanzaron un tamaño suficiente (~ 1,5 a 3 mm de diámetro), se utilizó la plataforma Cell X™ para seleccionar 12 clones individuales (seleccionados de la población más grande de colonias existentes según la morfología (es decir, alta proporción de núcleo a citoplasma), y características de crecimiento (es decir, densamente empaquetadas con un borde brillante de fase claramente demarcado y poca diferenciación espontánea)), que se transfirieron cada una a un pocillo separado de una placa de cultivo de 12 pocillos recubierta con laminina 521 para su expansión. Después de la recolección, se volvió a escanear el cultivo original para confirmar que las células deseadas se habían eliminado con éxito. Después del pase inicial, la concentración de O2 se elevó al 20 %, las iPSC se alimentaron diariamente y se pasaron a placas de cultivo recubiertas con laminina 521 usando Versene (CTS, Thermo Fisher Scientific) una vez que alcanzaron el 80 %. Excepto el traslado de placas de cultivo celular hacia y desde la incubadora (que se realiza a mano), todos los pasos, incluidas las imágenes, la alimentación y el paso, están automatizados. Para evitar la contaminación por el virus Sendai del tubo dispensador de medios y del cabezal, la transducción de células de fibroblastos se realizó manualmente en la cámara de procesamiento de células adyacente. En el paso 10, las líneas iPSC se sometieron a cariotipo y análisis de puntuación para confirmar la integridad y potencia genética. Para validar aún más este enfoque, las iPSC generadas en la plataforma Cell X™ se compararon con las generadas manualmente utilizando nuestros métodos publicados anteriormente [49].

Las IPSC fueron cariotipadas en metafase por el Laboratorio Molecular y de Citogenética Shivanand R. Patil de la Universidad de Iowa utilizando la plataforma de escaneo en metafase de Leica Microsystems y el software CytoVision versión 7.7. Las células se cultivaron in vitro y se detuvieron en la metafase con colcemid. Los cromosomas se tiñeron mediante el método de bandas G, se contaron y se evaluaron estructuralmente para detectar la presencia o ausencia de reordenamientos detectables. Se analizaron al menos 20 células para cada línea de iPSC. Para el análisis TaqMan hPSC ScoreCard™, se aisló el ARN total utilizando el kit de purificación de ARN NucleoSpin (Takara Bio, San José, CA). El ADNc se generó a partir de 1 µg de ARN utilizando el kit de síntesis de ADNc VILO (Thermo Fisher Scientific). Se añadió ADNc a una placa de puntuación TaqMan hPSC (Thermo Fisher Scientific) y se amplificó utilizando un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 6 Flex. Los resultados se analizaron utilizando el conjunto de análisis basado en la nube de Thermo Fisher.

La diferenciación de la retina se realizó con modificaciones para cumplir con las GMP como se describió anteriormente [31, 50]. Las IPSC se cultivaron en placas recubiertas con laminina 521 en medio E8. Los cuerpos embrioides (CE) se levantaron con ReLeSR (STEMCELL Technologies, Cambridge, MA) y se transfirieron de E8 a un medio de inducción neuronal (NIM-DMEM/F12 (1:1), suplemento de N2 al 1 %, aminoácidos no esenciales al 1 %, Glutamax al 1 % (Thermo Fisher Scientific), heparina 2 µg/mL (Sigma-Aldrich, St. Louis MO) y Primocin (InvivoGen, San Diego, CA)) durante un período de cuatro días. El día 6, NIM se complementó con BMP4 1,5 nM (R&D Systems, Minneapolis, MN). El día 7, los EB se adhirieron a placas recubiertas con Maxgel (Sigma-Aldrich). BMP4 salió gradualmente del NIM durante siete días. El día 16, el medio se cambió a medio de diferenciación retiniana (RDM - DMEM/F12 (3:1), suplemento de B27 al 2% (Thermo Fisher Scientific), aminoácidos no esenciales al 1%, Glutamax al 1% y Primocin al 0,2%). . En los días 25 a 30, todo el crecimiento de EB se levantó mecánicamente utilizando un raspador de células y se transfirió a matraces de fijación ultrabaja en 3D-RDM (RDM más reemplazo de suero KnockOut al 10% (KSR); Thermo Fisher Scientific), taurina 100 µM (Sigma -Aldrich), concentrado de lípidos químicamente definido 1:1000 (Thermo Fisher Scientific) y ácido retinoico todo trans 1 µM (hasta el día 100; Sigma-Aldrich). Las células se alimentaron tres veces por semana con 3D-RDM hasta la cosecha.

En los días 120 y 160, los organoides se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente y se equilibraron con un 15% de sacarosa en PBS, seguido de un 30% de sacarosa. Los organoides se criopreservaron en una solución 50:50 de sacarosa al 30 %/PBS: medio de congelación de tejidos (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) y se crioseccionaron (15 μm). Las secciones se bloquearon con suero de burro normal al 5 %, albúmina sérica bovina al 3 % y triton-x al 0,1 % y se tiñeron durante la noche con los siguientes anticuerpos primarios: OTX2 (R&D Systems; Cat# AF1979), Recoverin (EMD Millipore, Burlington, MA; Cat# AB5585), NRL (R&D Systems; Cat# AF2945), ARR3 (Lifespan Biosciences, Seattle, WA; Cat# LS-C368677), ML-Opsin (EMD Millipore; Cat# AB5405) y NR2E3 (R&D Systems; Cat# PP-H7223-00). Se incubaron los siguientes anticuerpos secundarios (Thermo Fisher Scientific) durante 1 h: burro anti-cabra 488 (Cat# R37118), burro anti-ratón 488 (Cat# A21202) y burro anti-conejo 647 (Cat# A31573). Los núcleos celulares se contratiñeron utilizando DAPI (Thermo Fisher Scientific; Cat# 62,248). Las imágenes se adquirieron utilizando un sistema de microscopio confocal vertical Leica TCS SPE (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania).

Se seleccionaron diez organoides representativos del cultivo. Se dejó que los organoides se sedimentaran por gravedad en un tubo de 1,5 ml y se aspiró el medio. Luego se disociaron los organoides con 20 unidades/mL de papaína (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, Nueva Jersey) con 60 unidades/mL de DNasa I (Worthington Biochemical Corporation) en un agitador a 37 ˚C durante aproximadamente 60 min. Después de la disociación, las células se sedimentaron a 400 x g durante 5 minutos, se resuspendieron en dPBS -/- (Thermo Fisher Scientific) con albúmina sérica bovina no acetilada al 0,04% (New England Biolabs, Ipswich, MA) y se procesaron inmediatamente para su encapsulación y códigos de barras utilizando el controlador Chromium (10X Genomics, Pleasanton, CA).

Las células se filtraron a través de un filtro de 70 µm y se diluyeron aún más para alcanzar 8000 células por ejecución. Luego, las células individuales se dividieron y se codificaron con el instrumento Chromium Controller (10X Genomics) y el kit Single Cell 3' Reagent (v3.1 chemistry) (10X Genomics) de acuerdo con las especificaciones del fabricante sin modificaciones (Rev C). Las bibliotecas finales se cuantificaron utilizando el kit de ensayo Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific) y se diluyeron a 3 ng/μl en tampón EB (Qiagen, Hilden, Alemania). La calidad y la concentración de la biblioteca se confirmaron utilizando el ensayo de ADN de alta sensibilidad Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) antes de la secuenciación.

Las bibliotecas de scRNA se secuenciaron utilizando el instrumento NovaSeq 6000 (Illumina, San Diego, CA) generando lecturas finales emparejadas de 100 pb. La secuenciación fue realizada por la División de Genómica del Instituto de Genética Humana de Iowa. Los archivos FASTQ se generaron a partir de llamadas base con el software bcl2fastq (Illumina) y las lecturas se asignaron a la referencia GRCh38 prediseñada con Cell Ranger (versión 6.0) (10X Genomics) utilizando la función "recuento". Sólo se analizaron más a fondo las células que pasaban la llamada predeterminada de Cell Ranger. En el análisis solo se incluyeron células con entre 500 y 7000 genes únicos (características) y con <15% de lecturas mapeadas a genes codificados por ADNmt y <25% de lecturas mapeadas a genes ribosomales.

Las bibliotecas filtradas se normalizaron con Seurat [51]. Las características variables se identificaron con el método de selección vst antes del escalado y reducción de dimensionalidad. Para comparar los datos recién generados con los estudios existentes, los datos de este manuscrito se integraron con datos de scRNA-seq generados previamente sobre el desarrollo de organoides retinianos en los días 90, 104 y 110 [52]. La integración se realizó con análisis de correlación canónica utilizando el paquete Seurat (v3.2.3). Para modelar la maduración de los progenitores en fotorreceptores, las células identificadas como progenitores de la retina, las células de transición (poblaciones T1 y T3) y los bastones se subconjuntos del objeto Seurat original. Aplicamos la reducción de dimensionalidad PHATE (v1.0.7) [53] a los datos integrados y escalados de la población del subconjunto de fotorreceptores y precursores. Se identificaron un total de 10 vecinos más cercanos para cada celda, y estos vecinos se usaron para construir el núcleo con un factor de desintegración de 75. A continuación, se usó el paquete slingshot R [54] para crear un análisis de trayectoria usando las incrustaciones PHATE, con la trayectoria comienza en la población progenitora.

La plataforma Cell X (Fig. 1A) es un sistema robótico de procesamiento de imágenes y líquidos capaz de automatizar muchos de los procedimientos intensivos en mano de obra necesarios para la generación de iPSC, al mismo tiempo que captura escaneos completos de pozos de alta resolución para permitir el monitoreo y la trazabilidad de cada paso. del proceso de fabricación de iPSC. Específicamente, la plataforma Cell X consta de una bomba de jeringa para recoger y desmalezar cultivos de iPSC (Fig. 1A1, B1), tres bombas peristálticas (Fig. 1A6 y C) conectadas a tres agujas de suministro independientes (Fig. 1B3 y D) para realizar intercambios de medios y una bomba peristáltica separada conectada a una línea de aspiración independiente (Fig. 1A2 y B2) utilizada para la aspiración de medios. Tanto la bomba de jeringa como la bomba de aspiración pueden recoger y desechar puntas de micropipeta desechables para mantener condiciones de cultivo celular asépticas (Fig. 1E). Esta plataforma de manipulación de líquidos está construida sobre un microscopio invertido automatizado con capacidades de fase y fluorescencia (Fig. 1A), que permite el seguimiento de cultivos desde el aislamiento de fibroblastos hasta la formación de colonias iPSC y la expansión clonal. Por ejemplo, utilizando microscopía de fase a partir de los 7 días posteriores a la transducción de fibroblastos, pudimos rastrear la formación de colonias de iPSC durante un período de 15 días. (Figuras 1F-J).

La plataforma Cell X Robotic para la generación automatizada de iPSC a partir de fibroblastos dérmicos primarios. A La plataforma Cell X consta de un sistema robótico de manipulación de líquidos (A1–A3 y A6) montado en un microscopio fluorescente invertido disponible comercialmente (A7). Se pueden colocar hasta dos placas multipocillos estándar en el sistema (A5), que es capaz de obtener imágenes de los cultivos, realizar intercambios de medios, eliminar células no deseadas y seleccionar colonias de iPSC, que luego se pueden transferir a diferentes pocillos o placas. A1 = bomba de jeringa, A2 = bomba de aspiración, A3 = cabezal de bomba dispensadora de medios, A4 = puntas de micropipeta desechables para la jeringa y las bombas de aspiración, A5 = etapa robótica que contiene dos placas de cultivo celular de múltiples pocillos, A6 = bombas peristálticas que Suministre medios a A3, A7 = microscopio automatizado. B La plataforma Cell X tiene capacidades sólidas de manejo de líquidos, habilitadas por una bomba de jeringa robótica (B1) para recoger y desherbar, una bomba de aspiración (B2) para eliminar los medios, así como tres bombas dispensadoras (B3) para agregar medios de cultivo y otros líquidos. reactivos a pocillos individuales. C La dispensación de reactivos líquidos y la aspiración se logra mediante bombas peristálticas controladas por software. D Se pueden colocar tres reactivos líquidos diferentes en los pocillos mediante agujas dispensadoras independientes. E Tanto la jeringa como la bomba de aspiración utilizan puntas de micropipeta desechables para garantizar condiciones de cultivo celular asépticas y evitar la contaminación cruzada entre muestras. F – J Las capacidades de imágenes automatizadas de la plataforma Cell X permiten monitorear el crecimiento de colonias de iPSC individuales a lo largo del tiempo. K Durante este estudio, hemos utilizado Cell X para generar 21 líneas iPSC a partir de muestras de fibroblastos dérmicos obtenidas de pacientes masculinos y femeninos de entre 14 y 88 años que padecen enfermedades que causan mutaciones en varios genes diferentes.

La selección de iPSC para la expansión clonal y la eliminación de células somáticas residuales o zonas de diferenciación espontánea son dos de los pasos que requieren más mano de obra en los protocolos modernos de generación de iPSC. Después de que las células somáticas aisladas de un paciente se transduzcan con factores de reprogramación, el cultivo resultante debe mantenerse y monitorearse durante varias semanas antes de que las colonias de iPSC reprogramadas crezcan lo suficiente como para ser seleccionadas (es decir, ~ 1,5-3 mm de diámetro). Durante este período, es posible que sea necesario eliminar o "eliminar" las células somáticas de las que se derivaron las iPSC para evitar que compitan con las iPSC recién reprogramadas. Una vez que las colonias de iPSC alcanzan un tamaño suficiente, se deben recolectar o "recoger" y volver a colocar en recipientes de cultivo celular individuales para la expansión clonal. Mientras las iPSC seleccionadas se expanden clonalmente, cualquier región que comience a diferenciarse espontáneamente debe eliminarse para mantener la integridad del cultivo de iPSC. Para líneas celulares con diferenciación espontánea excesiva, puede ser necesario volver a seleccionar las células deseadas en lugar de eliminar las células indeseables. La recolección y el deshierbe generalmente se realizan manualmente en un microscopio de fase utilizando una micropipeta. Estas tareas consumen mucho tiempo y requieren personal altamente calificado, especialmente cuando se realizan según cGMP. Por lo tanto, la automatización de estos procedimientos eliminaría un cuello de botella en el proceso de producción de terapias, lo que a su vez aumentaría el rendimiento. Para crear y validar procedimientos operativos estándar para la generación automatizada de iPSC, que incluye recolección, deshierbe y expansión clonal, se ampliaron y reprogramaron fibroblastos dérmicos obtenidos de los 21 individuos enumerados en la Fig. 1K. Se eligió esta cohorte porque tenía un amplio rango de edad (de 14 a 88 años con una edad promedio de 50,2 años), incluía 8 hombres y 13 mujeres y representaba a individuos normales (es decir, ND = sin enfermedad), así como a pacientes con enfermedades comunes ( es decir, formas asociadas a ABCA4) y raras (es decir, asociadas a CRB1) de degeneración retiniana hereditaria molecularmente confirmada.

La plataforma Cell X es capaz de recoger robóticamente colonias de iPSC utilizando una bomba de jeringa y una punta de micropipeta estéril. Para mantener la viabilidad y la pluripotencia celular, es importante minimizar el corte fluídico utilizado para levantar las células. Para optimizar los parámetros de selección (altura de la punta, volumen de aspiración y tasa de aspiración), se recogieron cultivos de iPSC entre 25 y 30 días después de la transducción (Fig. 2A). En este punto se encuentran colonias grandes y densas de entre 1,5 y 3 mm de diámetro. Como se muestra en la Fig. 2, el proceso de recolección implica colocar una punta estéril conectada a la bomba de jeringa en la placa de donante encima de una colonia y aspirar el volumen deseado de medio a una velocidad definida (B) antes de mover la etapa (C) de la placa donante al pocillo deseado en la placa receptora donde la muestra se dispensa en un pocillo que contiene medio de cultivo (D). El diámetro exterior de la punta de la pipeta de selección es de 733 μm y el número de selecciones necesarias para seleccionar una colonia completa está determinado por el tamaño de la colonia. Para acelerar el proceso de selección, cuando se selecciona de una sola colonia, se pueden realizar varias selecciones antes de pasar de la placa donante a la placa receptora. Después de seleccionar una colonia completa, se reemplaza la punta de la micropipeta antes de seleccionar la siguiente colonia.

Selección automatizada de iPSC derivadas de pacientes. A Después de la reprogramación, se monitoreó el crecimiento de las colonias de iPSC generadas a partir de fibroblastos dérmicos primarios utilizando la plataforma Cell X para capturar escaneos de pocillos completos cada vez que se alimentó el cultivo. B – D Una vez que las colonias de iPSC transformadas alcanzaron un tamaño suficiente, se utilizó la bomba de jeringa robótica de la plataforma Cell X para seleccionar células de áreas seleccionadas por un usuario del montaje de contraste de fase del pozo donante. La plataforma Cell X es capaz de montar y retirar automáticamente puntas de micropipeta desechables para mantener condiciones de cultivo celular asépticas. E – G, las tasas de aspiración utilizadas para recoger las iPSC se optimizaron para encontrar los valores más bajos de corte fluídico necesarios para levantar las células. Dado que la tensión de corte máxima se produce debajo del borde de la punta de la micropipeta, las células se levantan de una región anular debajo de este borde. Los puntos de selección superpuestos H-J permiten seleccionar colonias enteras sin aumentar el corte fluídico máximo aplicado

Como se muestra en la Fig. 2E-G, dado que la región de corte fluídico máximo corresponde al área debajo del borde de la punta de la micropipeta, la función de selección de la Celda X recolecta células en una región anular distintiva. Si bien se podrían obtener círculos completos aumentando la tasa de aspiración de la bomba de jeringa, esto aumentaría el corte máximo aplicado más allá de lo necesario, lo que ejercería una tensión indebida sobre las células que se recolectan. En su lugar, optamos por recolectar colonias completas superponiendo varios puntos de selección (Fig. 2H-J), lo que permite una precisión de selección óptima y una mayor supervivencia celular. Cuando se utiliza esta función para eliminar la diferenciación espontánea no deseada y eliminar las células somáticas en las primeras etapas del proceso de reprogramación, la velocidad y el volumen de aspiración se pueden aumentar para permitir una eliminación completa.

Las IPSC generadas utilizando la plataforma Cell X tenían morfología y cariotipo de iPSC normales (se analizaron 20 células por línea) (Fig. 3A, B). El análisis del cuadro de mando TaqMan hPSC mostró que las iPSC generadas utilizando la plataforma Cell X (automatizada) tenían una pluripotencia y una expresión de ectodermo del día 7 similares a las iPSC generadas manualmente (Fig. 3C, D, E). A continuación, modificamos los protocolos de diferenciación de retina publicados previamente [31, 50] para que cumplieran con cGMP (Fig. 4A) y las iPSC (B1427) se diferenciaron en el sistema Biospherix Xvivo. Las células mostraron una morfología normal en diferentes etapas de diferenciación retiniana: iPSC (Fig. 4B), cuerpos embrioides (EB) del día 7 (Fig. 4C), vesículas ópticas adjuntas del día 16 (Fig. 4D) y organoides retinianos elevados (Fig. 4E). ). Los organoides analizados el día 120 o el día 160 expresaron los marcadores de fotorreceptores OTX2, Recoverin, NRL, NR2E3, ARR3 y ML-Opsin (Fig. 4F-N). Los fibroblastos de la misma biopsia (B1427) se reprogramaron manualmente y mostraron una morfología y tinción similares después de diferentes etapas de diferenciación retiniana (archivo adicional 1: Fig. S1).

Validación de iPSC generadas en la plataforma Cell X. Micrografía de fase AA representativa de Cell X de iPSC generadas en la plataforma Cell X. Cariotipo representativo de BA de iPSC B1427. Análisis del cuadro de mando C – E TaqMan hPSC que compara las iPSC generadas mediante procesamiento manual o automatizado y sus EB del día 7. C Gráfico que compara las puntuaciones del algoritmo para la expresión de genes implicados en la autorrenovación o el linaje del ectodermo. El conjunto de referencia indiferenciado se indica mediante el diagrama de caja negra. D Coeficientes de correlación (valores r2). E Gráficos de expresión que muestran el cambio en la expresión de los genes dados en comparación con el conjunto de referencia indiferenciado

Diferenciación retiniana de iPSC generadas en la plataforma Cell X. Un esquema del protocolo de diferenciación de retina. Micrografía de fase representativa de las iPSC del día 0 (B), las EB del día 7 (C), las vesículas ópticas adheridas al día 16 (D) y los organoides retinianos levantados el día 55. Barra de escala = 1 mm. Tinción inmunohistoquímica de organoides retinianos el día 120 (F – I) y el día 160 (J – N). Los anticuerpos se dirigieron a los marcadores de células fotorreceptoras OTX2 (verde) y Recoverin (rojo), a los marcadores de células fotorreceptoras de bastón NRL y NR2E3 (verde) y al marcador de células fotorreceptoras de cono ARR3 y ML-Opsin (rojo). DAPI (azul) se utilizó como contratinción nuclear.

Para investigar la composición celular y la maduración de organoides diferenciados de las iPSC generadas en la plataforma Cell X, se utilizó la secuenciación de ARN unicelular. Se recuperaron células individuales de organoides retinianos en el día de diferenciación 120 (D120) y se anotaron en función de los perfiles de expresión génica (Fig. 5A). Se recuperaron todas las clases principales de células neurales de la retina, además de las poblaciones progenitoras y de transición descritas anteriormente [52]. Se confirmó la expresión de genes marcadores de fotorreceptores conocidos (Fig. 5B), donde los tipos de fotorreceptores de bastón y cono se pudieron diferenciar mediante la expresión de NRL y PDE6H respectivamente. A continuación, examinamos el linaje de diferenciación de bastones subconjuntos solo de células en el Progenitor, T1/T3 (poblaciones progenitoras en transición que se desarrollan hacia linajes de fotorreceptores [52] y grupos de bastones. Estas células se visualizaron en dos dimensiones usando PHATE, un método diseñado para preservar estructura global y transiciones del estado celular [53] (Fig. 5C). Se observó una trayectoria clara a través de los tipos de células esperados, lo que muestra que las células derivadas de organoides en nuestro sistema siguen linajes de desarrollo conocidos. Luego integramos nuestros datos con la secuenciación de ARN unicelular datos de organoides retinianos generados por Sridhar et al. [52]. La reducción de dimensionalidad se realizó en el nuevo conjunto de datos integrado y las células se anotaron como se describe anteriormente (Fig. 5D). Cada grupo en el conjunto de datos integrado resultante contenía células del estudio actual. así como los de Sridhar y otros (Fig. 5D), lo que indica similitud en los perfiles transcripcionales de las células de la retina generadas a partir de iPSC producidas utilizando la plataforma Cell X y las generadas manualmente en un laboratorio diferente.

Expresión génica en células individuales de organoides retinianos. Una incrustación UMAP bidimensional (aproximación y proyección múltiple uniforme) de células derivadas de organoides muestra la presencia de distintos tipos de células de la retina neural en el día 120 de diferenciación. B La expresión de genes marcadores específicos de tipo celular se muestra basándose en el sombreado de células individuales. Los fotorreceptores de bastón expresan NRL, los fotorreceptores de cono expresan PDE6H, todos los fotorreceptores expresan RCVRN y las poblaciones progenitoras y retinianas internas expresan PAX6. C La incrustación bidimensional de PHATE de células en el linaje de bastones demuestra células derivadas de organoides en diferentes etapas de diferenciación. D Incrustación UMAP bidimensional de células derivadas de organoides de este estudio integradas con las de un estudio anterior [52]. E Células en D coloreadas por estudio de origen. UI = células del estudio actual (generado en la Universidad de Iowa), UW = células de un estudio anterior ([52] generado en la Universidad de Washington). Las células generadas mediante el método descrito en el estudio actual se integran eficientemente con las descritas anteriormente.

El descubrimiento de que se podían generar células madre pluripotentes a partir de fibroblastos dérmicos mediante la expresión forzada de los genes c-MYC, OCT-3/4, KLF4, SOX2 [55], revolucionó el campo de la medicina regenerativa. Antes de esto, las CME pluripotentes eran el tipo de célula más favorable disponible para los laboratorios clínicos de reemplazo celular. El uso generalizado de ESC humanas permitió el desarrollo de protocolos de diferenciación altamente efectivos, incluidos aquellos diseñados para la derivación de células precursoras de fotorreceptores y progenitores de retina trasplantables [9, 10, 14, 15, 17, 28, 30, 36, 37, 38, 39].

Como las ESC se adaptan bien a la fabricación clínica a gran escala, siguen siendo una fuente de células ampliamente utilizada para el reemplazo celular clínico a pesar de su naturaleza alogénica y su probable necesidad de supresión inmune de por vida después del trasplante. Aunque las iPSC derivadas de pacientes reducen las preocupaciones sobre la compatibilidad entre el huésped y el donante, para que el reemplazo de células autólogas mediadas por iPSC sea viable, se necesita el desarrollo de tecnologías de fabricación compatibles con cGMP que permitan la producción paralela de múltiples líneas celulares por parte de un solo técnico. Con este fin, informamos el desarrollo de la plataforma Cell X, una plataforma robótica que puede automatizar muchos de los pasos que requieren mucha mano de obra y que son difíciles de realizar manualmente en grandes cantidades según cGMP. Específicamente, la obtención de imágenes y el seguimiento del linaje celular, el reemplazo de medios de cultivo celular, la selección de colonias de iPSC y la eliminación de la diferenciación espontánea son tareas para las que se ha diseñado la plataforma Cell X.

Una de las mayores ventajas de utilizar una plataforma robótica de cultivo celular, como la plataforma Cell X, es la capacidad de realizar tareas en ausencia de un usuario. Específicamente, una vez que se han proporcionado los comandos, se puede confiar en que la plataforma Cell X realizará una serie de tareas validadas, de la misma manera, día tras día. Esto no solo puede aumentar el rendimiento, sino que también reduce la variabilidad del producto entre lotes, lo que permite estar seguro de que es poco probable que cualquier diferencia biológica observada entre líneas celulares se deba a errores humanos, inconsistencias introducidas por ligeras variaciones técnicas o protocolos. deriva. Antes de implementar un sistema robótico en una línea de fabricación, es necesario desarrollar y validar procedimientos operativos estándar para la aplicación específica. En este estudio, estábamos interesados en desarrollar un sistema con la capacidad de rastrear los fibroblastos dérmicos de los pacientes desde el aislamiento hasta la reprogramación y la expansión clonal. Además, un objetivo importante era automatizar el proceso de selección de iPSC, una tarea que requiere mucho tiempo y es un desafío para el personal técnico realizarla manualmente, especialmente cuando está vestido de sala blanca. La estrategia de recolección que empleamos utiliza una bomba de jeringa para aspirar y dispensar colonias iPSC seleccionadas. Como se muestra en la Fig. 2, la colocación estratégica del anillo de recolección permite la recolección de toda la colonia o de selecciones parciales. Estos últimos son muy útiles para el muestreo y análisis después de la edición del genoma mediada por CRISPR. Además de su utilidad para aislar poblaciones de células deseadas, la bomba de jeringa también se puede utilizar para eliminar tipos de células diferenciadas espontáneamente indeseables. En áreas donde la diferenciación espontánea es mínima, las células diferenciadas se pueden aspirar y dispensar como desecho. Cuando existen áreas más grandes de diferenciación espontánea, la punta de la pipeta conectada a la bomba de jeringa se puede usar para raspar los tipos de células indeseables y el aspirador, que está controlado por una bomba peristáltica independiente, puede eliminar los medios y los desechos flotantes. La inclusión de tres bombas peristálticas adicionales, cada una de las cuales se puede conectar a un depósito de medio independiente, brinda al usuario la capacidad de incorporar un paso de lavado y recarga de medio, lo que permite la eliminación completa de tipos de células indeseables. En etapas posteriores de la expansión de iPSC, donde la recolección de iPSC y la eliminación de la diferenciación espontánea se vuelven infrecuentes, se puede usar la tercera bomba peristáltica para administrar una solución de paso no enzimática, como Versene, para el paso a gran escala de líneas celulares expandidas clonalmente.

Se han informado varios sistemas robóticos de cultivo celular, que van desde pequeños dispositivos de manipulación de líquidos [56, 57] hasta grandes plataformas multifunción independientes [58,59,60,61,62,63,64,65,66]. Por ejemplo, la plataforma CompacT SelecT (CTST) desarrollada por Tristan et al., en el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales, es una gran unidad independiente que incorpora una incubadora, un microscopio, un contador de células, varias bombas peristálticas y almacenamiento de medios refrigerados. área y dispositivo robótico de manipulación de placas [58]. Utilizando este sistema, los autores demostraron el cultivo simultáneo de hasta 90 líneas de iPSC humanas para un paso prolongado sin inducir anomalías cariotípicas o pérdida de potencia [58]. En una publicación reciente, Elanzew y sus colegas describieron un sistema similar al que denominaron StemCellFactory [59]. A diferencia del CTST, que funciona como un equipo independiente que podría colocarse en una suite de fabricación existente, StemCellFactory es una unidad modular que contiene más de 30 instrumentos integrados, todos alojados dentro de una gran campana de flujo laminar personalizada que se asemeja a una sala limpia [59]. Además de un dispositivo de manipulación de líquidos dedicado, dos incubadoras de cultivo celular, un microscopio automatizado y un transportador de placas robótico, este sistema incluye una plataforma de selección de colonias/células individuales disponible comercialmente (CellCelector™, Sartorius), que se utiliza para permitir la generación de hiPSC. y expansión [59]. Como se describió anteriormente, la plataforma Cell X fue diseñada para realizar varias de las diferentes tareas que realizan los módulos independientes en StemCellFactory: imágenes automatizadas, alimentación, recolección de células y deshierbe.

Como Cell X ocupa un espacio relativamente pequeño, se puede colocar dentro de una campana de flujo laminar estándar, que se puede colocar fácilmente en un entorno de sala limpia existente. En este estudio, optamos por colocar la plataforma Cell X dentro de un sistema Biospherix Xvivo compatible con cGMP (sistema ISO Clase 5 con monitoreo y rastreabilidad en tiempo real de gases, temperatura, humedad, COV y partículas) para permitir un mayor control sobre las condiciones atmosféricas. Específicamente, toda la unidad, que incluye la campana de flujo laminar que contiene la plataforma Cell X, la cámara de procesamiento adyacente que alberga los medios de cultivo celular y los reactivos de paso, y las incubadoras de cultivo celular, se mantiene a 37 °C con un 5 % de CO2 y la concentración de oxígeno requerida. para la tarea específica que se está realizando. Se ha demostrado que la reducción de la tensión de oxígeno mejora la tasa de reprogramación de iPSC [67]. Como la reprogramación de células somáticas de personas mayores puede resultar difícil [68], la capacidad de reducir la tensión de oxígeno atmosférico puede resultar extraordinariamente útil. En este estudio, se generaron, seleccionaron, expandieron clonalmente y mantuvieron iPSC derivadas de pacientes a una tensión de oxígeno del 10%. Una vez que se completó la reprogramación, la tensión de oxígeno se elevó al 20% para el cultivo de iPSC a largo plazo y la diferenciación de retina en 3D. En etapas posteriores de diferenciación, los organoides retinianos pueden volverse grandes y difíciles de perfundir. Para mejorar la viabilidad de las células de la retina en condiciones de cultivo prolongadas, se han utilizado niveles elevados de oxígeno. Por ejemplo, en uno de los primeros protocolos publicados, Nakano y sus colegas informaron sobre el cultivo de organoides retinianos 3D con una tensión de oxígeno del 40 % [30], lo que se puede lograr fácilmente utilizando la plataforma combinada Biospherix/Cell X que se presenta aquí.

A diferencia de CTST y StemCellFactory, que tienen brazos robóticos diseñados para transferir placas de cultivo celular de una estación a la siguiente, cuando se utiliza Cell X, debe estar presente un técnico para transferir manualmente placas y consumibles tanto dentro como fuera del dispositivo. Para permitir la fabricación continua, actualmente se están incorporando un brazo robótico colaborativo de 6 ejes (Universal Robots, Odense, Dinamarca), una incubadora de alta capacidad (Liconic STX-500, Mauren, Liechtenstein) y un software de programación maestra personalizado. El brazo robótico de 6 ejes moverá placas de células desde la incubadora de alta capacidad y consumibles desde sus ubicaciones de almacenamiento a la plataforma Cell X para permitir la generación, el cultivo y la diferenciación de iPSC con manos libres. El software de programación maestra personalizado se está diseñando para permitir que un técnico establezca una serie de tareas para cada línea celular desde el inicio de la reprogramación hasta la diferenciación de la retina, que pueden modificarse según sea necesario según el análisis de datos en tiempo real. Si al revisar los datos de imágenes se determina que es necesario realizar un paso posterior antes o después de lo planeado originalmente, se puede modificar la fecha y todos los pasos posteriores ajustarse en consecuencia. Por ejemplo, el protocolo de generación de iPSC utilizado en este estudio especifica que las colonias iniciales se recolectarán aproximadamente 25 días después de la transducción viral de Sendai de los fibroblastos dérmicos del paciente. Si el programa original se estableció para obtener imágenes y alimentar células transducidas diariamente con recolección de colonias el día 25, pero el día 24 la revisión de datos reveló que las colonias estaban creciendo más lentamente y aún no habían alcanzado el tamaño deseado, entonces la recolección podría retrasarse y el proceso posterior Las fechas de expansión clonal, pases y diferenciación se ajustan en consecuencia.

En este trabajo, hemos demostrado que la plataforma Cell X se puede utilizar para automatizar muchos de los pasos que requieren mucho tiempo y mano de obra para la generación de iPSC. Como puede obtener imágenes de toda la superficie del cultivo celular en cualquier frecuencia, permite un nivel de rastreabilidad que no es posible utilizando métodos estándar de cultivo celular e imágenes. Si bien el desarrollo de protocolos es fundamental, una vez que se ha validado un procedimiento operativo estándar compatible con Cell X, la plataforma se puede utilizar para completar tareas sin desviaciones, lo que da como resultado una variación excepcionalmente baja entre lotes. En conjunto, estas características aumentan en gran medida tanto la capacidad de producción de un solo técnico como la calidad del producto que se está desarrollando, lo que lo hace ideal para incorporarlo a una línea de producción clínica.

Los datos de expresión de ARN unicelular que respaldan los hallazgos presentados en este estudio se informan en su totalidad y estarán disponibles para descarga pública (GEO # GSE220154). Todos los demás datos están disponibles en el artículo y en el material complementario en línea.

Sistema nervioso periférico

Sistema nervioso central

Células madre pluripotentes inducidas

Esencial 8 medio

Células madre embrionarias

Buenas prácticas de fabricación actuales

Cuerpos embrioides

Ninguna enfermedad

Secuenciación de ARN unicelular

Starzl TE. Los primeros días del trasplante. JAMA. 1994;272(21):1705.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vanholder R, Domínguez-Gil B, Busic M, Cortez-Pinto H, Craig JC, Jager KJ, et al. Donación y trasplante de órganos: un llamado a la acción de múltiples partes interesadas. Nat Rev Nephrol. 2021;17(8):554–68.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Aubert O, Yoo D, Zielinski D, Cozzi E, Cardillo M, Durr M, et al. Pandemia de COVID-19 y trasplante de órganos en todo el mundo: un estudio poblacional. Salud pública de Lancet. 2021;6(10):e709–e19.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang Y, Klassen HJ, Tucker BA, Pérez MT, Young MJ. Las células progenitoras del SNC promueven un entorno permisivo para el crecimiento de neuritas a través de un mecanismo dependiente de la metaloproteinasa-2 de la matriz. J Neurosci. 2007;27(17):4499–506.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Luo J, Baranov P, Patel S, Ouyang H, Quach J, Wu F, et al. El trasplante de células progenitoras de retina humana preserva la visión. J Biol Chem. 2014;289(10):6362–71.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Han IC, Bohrer LR, Gibson-Corley KN, Wiley LA, Shrestha A, Harman BE, et al. Biocompatibilidad de injertos de células progenitoras de retina derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos en ratas inmunocomprometidas. Transpl. celular 2022;31:9636897221104451.

Artículo de Google Scholar

Tucker BA, Park IH, Qi SD, Klassen HJ, Jiang C, Yao J, et al. El trasplante de precursores de fotorreceptores derivados de células iPS de ratón adulto restaura la estructura y función de la retina en ratones degenerativos. Más uno. 2011;6(4):e18992.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mandai M, Fujii M, Hashiguchi T, Sunagawa GA, Ito SI, Sun J, et al. Los trasplantes de retina derivados de iPSC mejoran la visión en ratones con degeneración de retina en etapa terminal rd1. Informes de células madre. 2017;8(1):69–83.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin B, McLelland BT, Aramant RB, Thomas BB, Nistor G, Keirstead HS, et al. Los trasplantes de organoides de retina desarrollan fotorreceptores y mejoran la función visual en ratas RCS con disfunción del EPR. Invierta Ophthalmol Vis Sci. 2020;61(11):34.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McLelland BT, Lin B, Mathur A, Aramant RB, Thomas BB, Nistor G, et al. Las láminas organoides de retina trasplantadas derivadas de hESC diferencian, integran y mejoran la función visual en ratas con retina degenerada. Invierta Ophthalmol Vis Sci. 2018;59(6):2586–603.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zerti D, Hilgen G, Dorgau B, Collin J, Ader M, Armstrong L, et al. Los precursores de fotorreceptores derivados de células madre pluripotentes trasplantados provocan respuestas luminosas convencionales e inusuales en ratones con degeneración retiniana avanzada. Células madre. 2021;39(7):882–96.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Santos-Ferreira T, Volkner M, Borsch O, Haas J, Cimalla P, Vasudevan P, et al. Los trasplantes de fotorreceptores derivados de células madre se integran de manera diferencial en modelos de ratón con distrofia de conos y bastones. Invierta Ophthalmol Vis Sci. 2016;57(7):3509–20.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Gagliardi G, Ben M, Barek K, Chaffiol A, Slembrouck-Brec A, Conart JB, Nanteau C, et al. Caracterización y trasplante de fotorreceptores CD73 positivos aislados de organoides retinianos derivados de iPSC humanos. Informes de células madre. 2018;11(3):665–80.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chao JR, Lamba DA, Klesert TR, Torre A, Hoshino A, Taylor RJ, et al. Trasplante de células retinianas derivadas de células madre embrionarias humanas al espacio subretiniano de un primate no humano. Transl Vis Sci Technol. 2017;6(3):4.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu J, Cifuentes H, Reynolds J, Lamba DA. La inmunosupresión mediante la pérdida de IL2rgamma mejora la integración funcional a largo plazo de los fotorreceptores derivados de hESC en la retina del ratón. Célula madre celular. 2017;20(3):374–84. e5.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lamba DA, McUsic A, Hirata RK, Wang PR, Russell D, Reh TA. Generación, purificación y trasplante de fotorreceptores derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos. Más uno. 2010;5(1):e8763.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Lamba DA, Gust J, Reh TA. El trasplante de fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas restaura parte de la función visual en ratones con deficiencia de crx. Célula madre celular. 2009;4(1):73–9.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lingam S, Liu Z, Yang B, Wong W, Parikh BH, Ong JY, et al. Las células precursoras de fotorreceptores de retina derivadas de iPSC humanas de grado cGMP rescatan el daño de los fotorreceptores de cono en primates no humanos. Tratamiento de células madre. 2021;12(1):464.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aboualizadeh E, Phillips MJ, McGregor JE, DiLoreto DA Jr, Strazzeri JM, Dhakal KR, et al. Imágenes de fotorreceptores trasplantados en primates no humanos vivos con resolución unicelular. Informes de células madre. 2020;15(2):482–97.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kruczek K, González-Cordero A, Goh D, Naeem A, Jonikas M, Blackford SJI, et al. Diferenciación y trasplante de fotorreceptores de conos derivados de células madre embrionarias en un modelo de ratón con degeneración retiniana en etapa terminal. Informes de células madre. 2017;8(6):1659–74.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

González-Cordero A, West EL, Pearson RA, Durán Y, Carvalho LS, Chu CJ, et al. Los precursores de fotorreceptores derivados de cultivos tridimensionales de células madre embrionarias se integran y maduran dentro de la retina degenerada de un adulto. Nat Biotecnología. 2013;31(8):741–7.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ballios BG, Cooke MJ, Donaldson L, Coles BL, Morshead CM, van der Kooy D, et al. Un hidrogel inyectable a base de hialuronano mejora la supervivencia y la integración de la progenie de células madre después del trasplante. Informes de células madre. 2015;4(6):1031–45.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Klassen H, Sakaguchi DS, Young MJ. Células madre y reparación de retina. Prog Retin Eye Res. 2004;23(2):149–81.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Eberle D, Santos-Ferreira T, Grahl S, Ader M. Trasplante subretiniano de células precursoras de fotorreceptores purificadas MACS en la retina de un ratón adulto. J Vis Exp. 2014(84):e50932.

Lakowski J, González-Cordero A, West EL, Han YT, Welby E, Naeem A, et al. Trasplante de precursores de fotorreceptores aislados mediante un panel de biomarcadores de superficie celular de retina autoformada derivada de células madre embrionarias. Células madre. 2015;33(8):2469–82.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Semo M, Haamedi N, Stevanato L, Carter D, Brooke G, Young M, et al. Eficacia y seguridad de las células progenitoras de la retina humana. Transl Vis Sci Technol. 2016;5(4):6.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Aftab U, Jiang C, Tucker B, Kim JY, Klassen H, Miljan E, et al. Cinética de crecimiento y trasplante de células progenitoras de retina humana. Res. ocular exp. 2009;89(3):301–10.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Meyer JS, Shearer RL, Capowski EE, Wright LS, Wallace KA, McMillan EL, et al. Modelado del desarrollo temprano de la retina con células madre pluripotentes inducidas y embrionarias humanas. Proc Natl Acad Sci EE.UU. A. 2009;106(39):16698–703.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meyer JS, Howden SE, Wallace KA, Verhoeven AD, Wright LS, Capowski EE, et al. Las estructuras similares a vesículas ópticas derivadas de células madre pluripotentes humanas facilitan un enfoque personalizado para el tratamiento de enfermedades de la retina. Células madre. 2011;29(8):1206–18.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nakano T, Ando S, Takata N, Kawada M, Muguruma K, Sekiguchi K, et al. Autoformación de copas ópticas y retina neural estratificada almacenable a partir de ESC humanas. Célula madre celular. 2012;10(6):771–85.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Capowski EE, Samimi K, Mayerl SJ, Phillips MJ, Pinilla I, Howden SE, et al. Reproducibilidad y estadificación de organoides de retina humana 3D en múltiples líneas de células madre pluripotentes. Desarrollo. 2019. https://doi.org/10.1242/dev.171686.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Phillips MJ, Pérez ET, Martin JM, Reshel ST, Wallace KA, Capowski EE, et al. El modelado del desarrollo de la retina humana con células madre pluripotentes inducidas específicas del paciente revela múltiples funciones para el homeobox 2 del sistema visual. 2014;32(6):1480–92.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wiley LA, Burnight ER, DeLuca AP, Anfinson KR, Cranston CM, Kaalberg EE, et al. Producción de cGMP de iPSC específicas del paciente y células precursoras de fotorreceptores para tratar la ceguera degenerativa de la retina. Representante de ciencia 2016;6:30742.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reichman S, Terray A, Slembrouck A, Nanteau C, Orieux G, Habeler W, et al. Desde células iPS humanas confluentes hasta retina neural autoformada y epitelio pigmentado de la retina. Proc Natl Acad Sci EE.UU. A. 2014;111(23):8518–23.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhong X, Gutiérrez C, Xue T, Hampton C, Vergara MN, Cao LH, et al. Generación de tejido retiniano tridimensional con fotorreceptores funcionales a partir de iPSC humanas. Comuna Nacional. 2014;5:4047.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

[Artículo gratuito de PMC] [PubMed] Kuwahara A, Ozone C, Nakano T, Saito K, Eiraku M, Sasai Y. Generación de un nicho de células madre similar al margen ciliar a partir de tejido retiniano humano autoorganizado. Comuna Nacional. 2015;6:6286.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mellough CB, Collin J, Khazim M, White K, Sernagor E, Steel DH, et al. La señalización de IGF-1 juega un papel importante en la formación de retina neural laminada tridimensional y otras estructuras oculares a partir de células madre embrionarias humanas. Células madre. 2015;33(8):2416–30.

Artículo PubMed Google Scholar

Singh RK, Mallela RK, Cornuet PK, Reifler AN, Chervenak AP, West MD, et al. Caracterización de tejido retiniano tridimensional derivado de células madre embrionarias humanas en cultivos monocapa adherentes. Desarrollo de células madre. 2015;24(23):2778–95.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lowe A, Harris R, Bhansali P, Cvekl A, Liu W. La supervivencia celular dependiente de la adhesión intercelular y las fuerzas impulsadas por actomiosina reguladas por ROCK median la autoformación de un organoide retiniano. Informes de células madre. 2016;6(5):743–56.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

González-Cordero A, Kruczek K, Naeem A, Fernando M, Kloc M, Ribeiro J, et al. La recapitulación del desarrollo de la retina humana a partir de células madre pluripotentes humanas genera poblaciones trasplantables de fotorreceptores de conos. Informes de células madre. 2017;9(3):820–37.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Wahlin KJ, Maruotti JA, Sripathi SR, Ball J, Angueyra JM, Kim C, et al. Estructuras similares a segmentos externos de fotorreceptores en retinas 3D a largo plazo de células madre pluripotentes humanas. Representante científico 2017;7(1):766.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Ovando-Roche P, West EL, Branch MJ, Sampson RD, Fernando M, Munro P, et al. El uso de biorreactores para cultivar organoides de retina humana mejora el rendimiento de los fotorreceptores. Tratamiento de células madre. 2018;9(1):156.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hallam D, Hilgen G, Dorgau B, Zhu L, Yu M, Bojic S, et al. Las células madre pluripotentes inducidas por humanos generan organoides retinianos que responden a la luz con una eficiencia variable y dependiente de los nutrientes. Células madre. 2018;36(10):1535–51.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Luo Z, Zhong X, Li K, Xie B, Liu Y, Ye M, et al. Un sistema optimizado para la derivación eficaz de tejido retiniano tridimensional mediante la regulación de señalización wnt. Células madre. 2018;36(11):1709–22.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Registro de células madre embrionarias humanas del NIH. https://grants.nih.gov/stem_cells/registry/current.htm. Consultado el 27 de febrero de 2023.

Guha P, Morgan JW, Mostoslavsky G, Rodrigues NP, Boyd AS. Falta de respuesta inmune a células diferenciadas derivadas de células madre pluripotentes inducidas singénicas. Célula madre celular. 2013;12(4):407–12.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Singh VK, Kalsan M, Kumar N, Saini A, Chandra R. Células madre pluripotentes inducidas: aplicaciones en medicina regenerativa, modelado de enfermedades y descubrimiento de fármacos. Biol de desarrollo de células frontales. 2015;3:2.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Mantripragada VP, Luangphakdy V, Hittle B, Powell K, Muschler GF. Caracterización automatizada durante el proceso y selección de clones celulares para una fabricación celular eficiente y de calidad. Citotecnología. 2020;72(5):615–27.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wiley LA, Anfinson KR, Cranston CM, Kaalberg EE, Collins MM, Mullins RF, et al. Generación de iPSC específicas para pacientes libres de xeno y compatibles con cGMP a partir de biopsia de piel. Curr Protoc Biol de células madre. 2017. https://doi.org/10.1002/cpsc.30.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Bohrer LR, Wiley LA, Burnight ER, Cooke JA, Giacalone JC, Anfinson KR, et al. Corrección de iPSC específicas del paciente con síndrome de cono s mejorado asociado a NR2E3 mediante CRISPR-Cas9. Genes (Basilea). 2019. https://doi.org/10.3390/genes10040278.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Hao Y, Hao S, Andersen-Nissen E, Mauck WM, Zheng S, Butler A, et al. Análisis integrado de datos unicelulares multimodales. Celúla. 2021;184(13):3573-87e29.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sridhar A, Hoshino A, Finkbeiner CR, Chitsazan A, Dai L, Haugan AK, et al. Comparación transcriptómica unicelular de retina fetal humana, organoides retinianos derivados de hPSC y cultivos de retina a largo plazo. Representante celular 2020;30(5):1644–59e4.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moon KR, van Dijk D, Wang Z, Gigante S, Burkhardt DB, Chen WS, et al. Visualización de estructuras y transiciones en datos biológicos de alta dimensión. Nat Biotecnología. 2019;37(12):1482–92.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Street K, Risso D, Fletcher RB, Das D, Ngai J, Yosef N, et al. Slingshot: linaje celular e inferencia de pseudotiempo para transcriptómica unicelular. Genómica BMC. 2018;19(1):477.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, et al. Inducción de células madre pluripotentes a partir de fibroblastos humanos adultos mediante factores definidos. Celúla. 2007;131(5):861–72.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Manstein F, Ullmann K, Kropp C, Halloin C, Triebert W, Franke A, et al. Bioprocesamiento de alta densidad de células madre pluripotentes humanas mediante control metabólico y modelado in silico. Células madre Transl Med. 2021;10(7):1063–80.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schwedhelm I, Zdzieblo D, Appelt-Menzel A, Berger C, Schmitz T, Schuldt B, et al. Monitoreo automatizado en tiempo real de la agregación de células madre pluripotentes humanas en reactores de tanque agitado. Representante científico 2019;9(1):12297.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Tristan CA, Ormanoglu P, Slamecka J, Malley C, Chu PH, Jovanovic VM, et al. Biofabricación robótica de alto rendimiento y diferenciación funcional de células madre pluripotentes humanas. Informes de células madre. 2021;16(12):3076–92.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Elanzew A, Niessing B, Langendoerfer D, Rippel O, Piotrowski T, Schenk F, et al. StemCellFactory: una integración de sistema modular para la generación y expansión automatizadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. Frente Bioeng Biotechnol. 2020;8:580352.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Sasamata M, Shimojo D, Fuse H, Nishi Y, Sakurai H, Nakahata T, et al. Establecimiento de una plataforma sólida para la investigación de células madre pluripotentes inducidas utilizando Maholo LabDroid. Tecnología SLAS. 2021;26(5):441–53.

Artículo PubMed Google Scholar

Paull D, Sevilla A, Zhou H, Hahn AK, Kim H, Napolitano C, et al. Derivación, caracterización y diferenciación automatizadas y de alto rendimiento de células madre pluripotentes inducidas. Métodos Nat. 2015;12(9):885–92.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ma Z, Toledo MAS, Wanek P, Elsafi Mabrouk MH, Smet F, Pulak R, et al. Clasificación de grupos de células en la diferenciación automatizada de células madre pluripotentes inducidas específicas del paciente hacia células sanguíneas. Frente Bioeng Biotechnol. 2022;10:755983.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Konagaya S, Ando T, Yamauchi T, Suemori H, Iwata H. Mantenimiento a largo plazo de células madre pluripotentes inducidas por humanos mediante un sistema de cultivo celular automatizado. Representante de ciencia ficción 2015;5:16647.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dhingra A, Tager J, Bressan E, Rodríguez-Nieto S, Bedi MS, Broer S, et al. Producción automatizada de neuronas corticales y dopaminérgicas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos con monitorización integrada de células vivas. J Vis Exp. 2020. https://doi.org/10.3791/61525.

Artículo PubMed Google Scholar

Haupt S, Grutzner J, Thier MC, Kallweit T, Rath BH, Laufenberg I, et al. Selección y recolección automatizadas de colonias de células madre pluripotentes. Biotechnol Appl Biochem. 2012;59(2):77–87.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

McLaren D, Gorba T, Marguerie de Rotrou A, Pillai G, Chappell C, Stacey A, et al. Cultivo automatizado a gran escala y detección química de rendimiento medio para moduladores de la proliferación y viabilidad de células madre de tipo neuroepitelial derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. Pantalla J Biomol. 2013;18(3):258–68.

Artículo PubMed Google Scholar

Yoshida Y, Takahashi K, Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. La hipoxia mejora la generación de células madre pluripotentes inducidas. Célula madre celular. 2009;5(3):237–41.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mahmoudi S, Brunet A. Envejecimiento y reprogramación: una vía de doble sentido. Opinión actual Cell Biol. 2012;24(6):744–56.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Los datos de RNA-seq presentados en este documento fueron generados por la División de Genómica del Instituto de Genética Humana de Iowa, que cuenta con el apoyo, en parte, de la Facultad de Medicina Carver de la Universidad de Iowa.

Esta investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud R01 EY033331.

Instituto de Investigación de la Visión, Carver College of Medicine, Universidad de Iowa, 375 Newton Road, Iowa City, IA, 52242, EE. UU.

Laura R. Bohrer, Nicholas E. Stone, Nathaniel K. Mullin, Andrew P. Voigt, Kristin R. Anfinson, Jessica L. Fick, Robert F. Mullins, Edwin M. Stone y Budd A. Tucker

Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales, Carver College of Medicine, Universidad de Iowa, Iowa City, IA, EE. UU.

Laura R. Bohrer, Nicholas E. Stone, Nathaniel K. Mullin, Andrew P. Voigt, Kristin R. Anfinson, Jessica L. Fick, Robert F. Mullins, Edwin M. Stone y Budd A. Tucker

Departamento de Informática Biomédica, Universidad Estatal de Ohio, Columbus, OH, EE. UU.

Bradley Hittle y Kimerly Powell

Departamento de Ingeniería Biomédica, Instituto de Investigación Lerner, Clínica Cleveland, Cleveland, OH, EE. UU.

Viviane Luangphakdy y George F. Muschler

Departamento de Cirugía Ortopédica, Clínica Cleveland, Cleveland, OH, EE. UU.

George F. Muschler

Cell X Technologies Inc, Cleveland, OH, EE. UU.

Viviane Luangphakdy

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LRB, NES, NKM, BH, KP, VL, GM, RFM, EMS y BAT concibieron y diseñaron los experimentos e interpretaron los datos. LRB, NKM, KRA, APV realizaron los experimentos, recopilaron y analizaron los datos. LRB, NES, NKM, RFM, EMS, BAT escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Budd A. Tucker.

Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Iowa (aprobación de proyecto n.º 200202022) y se adhirió a los principios establecidos en la Declaración de Helsinki.

No aplica.

KP es consultor remunerado y accionista de Cell X Technologies Inc. GM es el director de tecnología y accionista de Cell X Technologies Inc. VL es empleado y accionista de Cell X Technologies Inc.

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Diferenciación retiniana de iPSC generadas manualmente. Micrografía de fase representativa de las iPSC del día 0 (A), las EB del día 7 (B) y los organoides retinianos levantados el día 40 (C). Barra de escala = 250 m (A) y 1 mm (B, C). Tinción inmunohistoquímica de organoides retinianos el día 120 (D – G) y el día 160 (H – N). Los anticuerpos se dirigieron a los marcadores de células fotorreceptoras OTX2 (rojo) y Recoverin (verde), a los marcadores de células fotorreceptoras de bastón NRL (rojo) y NR2E3 (verde) y al marcador de células fotorreceptoras de cono ARR3 (verde (D, E, H, I) y rojo ( L, N)). DAPI (azul) se utilizó como contratinción nuclear.

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Reimpresiones y permisos

Bohrer, LR, Stone, NE, Mullin, NK et al. Automatización de la generación de iPSC para permitir la terapia de reemplazo de células fotorreceptoras autólogas. J Transl Med 21, 161 (2023). https://doi.org/10.1186/s12967-023-03966-2

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Recibido: 09 de diciembre de 2022

Aceptado: 03 de febrero de 2023

Publicado: 28 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12967-023-03966-2

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