La haploinsuficiencia MYT1L en neuronas humanas y ratones causa autismo

Psiquiatría molecular (2023)Citar este artículo

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MYT1L es un factor de transcripción asociado al trastorno del espectro autista (TEA) que se expresa prácticamente en todas las neuronas a lo largo de la vida. Sigue siendo enigmático cómo las mutaciones MYT1L causan fenotipos neurológicos y si pueden ser atacadas. Aquí, examinamos los efectos de la deficiencia de MYT1L en neuronas humanas y ratones. Los ratones mutantes exhiben retrasos en el desarrollo neurológico con cortezas más delgadas, fenotipos de comportamiento y cambios en la expresión genética que se asemejan a los de los pacientes con TEA. Los genes diana de MYT1L, incluidos WNT y NOTCH, se activan tras el agotamiento de MYT1L y su inhibición química puede rescatar la neurogénesis retrasada in vitro. La deficiencia de MYT1L también causa una regulación positiva del principal canal de sodio cardíaco, SCN5A, e hiperactividad neuronal, que podría restaurarse mediante la eliminación mediada por shRNA de la sobreexpresión de SCN5A o MYT1L en neuronas posmitóticas. La aplicación aguda del bloqueador de los canales de sodio, lamotrigina, también rescató defectos electrofisiológicos in vitro y fenotipos de comportamiento in vivo. Por lo tanto, la mutación MYT1L causa defectos neurológicos tanto del desarrollo como posmitóticos. Sin embargo, la intervención aguda puede normalizar los fenotipos electrofisiológicos y conductuales resultantes en la edad adulta.

El trastorno del espectro autista (TEA) es un trastorno del desarrollo neurológico (NDD) común caracterizado por cambios de comportamiento, incluidos patrones sociales alterados [1]. El TEA a menudo se asocia con afecciones coexistentes, como epilepsia, discapacidad intelectual e hiperactividad. Las mutaciones genéticas que afectan la comunicación neuronal confieren un mayor riesgo de TEA y ofrecen posibles objetivos terapéuticos [2]. Sin embargo, la heterogeneidad genética del TEA es enorme y recientemente se han asociado múltiples reguladores transcripcionales con este grupo de trastornos. De hecho, los modelos de ratón muestran que las mutaciones de los remodeladores de la cromatina, como Chd8 y miembros del complejo BAF como Smarcc2, pueden inducir fenotipos conductuales [3,4,5,6], lo que sugiere un posible papel causal en el TEA. Sin embargo, su contribución a la enfermedad y su relevancia clínica a menudo siguen siendo difíciles de alcanzar [7], lo que limita el desarrollo de tratamientos específicos para los trastornos mentales asociados a reguladores genéticos en el momento del diagnóstico [8, 9].

De los 91 reguladores de cromatina o genes más fuertemente asociados con el TEA (categoría 1; [10]), MYT1L se expresa específica y continuamente en prácticamente todas las neuronas a lo largo de la vida [10,11,12]. MYT1L es un factor de transcripción de dedos de zinc conservado y se han informado mutaciones en pacientes diagnosticados con discapacidad intelectual, esquizofrenia, epilepsia y TEA [13,14,15,16,17,18], lo que sugiere que la regulación genética mediada por MYT1L puede ser importante. en la prevención de las NDD, incluido el TEA. De hecho, el 98% (50 de 51) de los casos notificados actualmente con deleción heterocigótica de MYT1L o mutaciones de pérdida de función fueron diagnosticados con TEA y/o discapacidad intelectual [19]. Además de las características de comportamiento, varios pacientes con mutaciones MYT1L también muestran retrasos en el desarrollo, obesidad, convulsiones y malformaciones cerebrales [19]. MYT1L fue uno de los tres factores originales capaces de reprogramar directamente los fibroblastos en neuronas funcionales tras la sobreexpresión [20]. MYT1L es un represor transcripcional que puede mejorar la identidad neuronal in vitro al reprimir activamente varias vías de desarrollo, incluidas WNT y NOTCH. Esto se logra en parte mediante el reclutamiento de silenciadores epigenéticos como SIN3/HDAC [21,22,23]. Inesperadamente, los experimentos de reprogramación también han revelado que MYT1L se une y reprime varios programas de genes no neuronales, como genes de músculos y fibroblastos, lo que sugiere un papel como salvaguardia panneuronal que silencia otros genes específicos del linaje [21, 24, 25]. De hecho, estudios recientes describieron que la haploinsuficiencia de Myt1l, causada por una mutación por cambio de marco del exón 15 de Myt1l o la eliminación del exón 9, indujo una alteración del desarrollo cerebral y fenotipos de comportamiento en ratones [26, 27]. Sin embargo, una serie de preguntas importantes siguen sin respuesta. Por ejemplo, no está claro si distintas mutaciones de MYT1L causan fenotipos superpuestos, como lo sugieren los informes de los pacientes. Además, ningún estudio presenta los efectos del agotamiento de MYT1L en las neuronas humanas. Finalmente, se desconocen los mecanismos moleculares que causan los fenotipos neurológicos y si son susceptibles de intervención.

Aquí, utilizamos ratones genéticamente modificados y neuronas inducidas por humanos para investigar el papel de MYT1L durante el desarrollo y como una nueva plataforma preclínica para estudiar las NDD asociadas a MYT1L. Utilizando estos modelos traslacionales, demostramos que la deficiencia de MYT1L es suficiente para inducir fenotipos asociados al autismo, que van desde la desregulación de la expresión genética y el retraso de la neurogénesis hasta el adelgazamiento cortical y la alteración del comportamiento. Los genes diana de MYT1L, incluidos los reguladores WNT y NOTCH, se activaron tempranamente tras el agotamiento de MYT1L en las neuronas humanas y la inhibición de la vía química podría rescatar los defectos de diferenciación asociados. Descubrimos que la pérdida de MYT1L también provocó una regulación positiva de genes no neuronales, incluido el canal de sodio cardíaco SCN5A, y desencadenó una hiperactividad inesperada de la red neuronal que puede rescatarse mediante la sobreexpresión de MYT1L o la eliminación de SCN5A. Además, la aplicación aguda del fármaco aprobado lamotrigina rescató los fenotipos electrofisiológicos en neuronas posmitóticas de ratones y humanos, así como los fenotipos de comportamiento en ratones adultos, proporcionando una posible vía terapéutica para pacientes con síndrome MYT1L.

No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Todos los valores, incluidas las réplicas y el análisis estadístico, están disponibles en las tablas complementarias S2-8, 13. Las células para el análisis in vitro se seleccionaron al azar y los ratones se asignaron al azar a los grupos de tratamiento. Los investigadores estaban cegados respecto de las grabaciones del parche, otros experimentos no fueron aleatorios.

Para modelar la pérdida de MYT1L, generamos una mutación de la línea germinal en ratones que albergan un cambio de marco de 7 pb en el exón 6 de Myt1l. Además, diseñamos un alelo MYT1L heterocigoto condicional en ESC humanas, lo que permite la eliminación mediada por cre del exón 7 en neuronas humanas. Observamos la reducción esperada de la proteína MYT1L de longitud completa en neuronas humanas y de ratón. En ratones mutantes encontramos una isoforma de proteína MYT1L truncada que carecía de localización y función nuclear, lo que confirma la validez de nuestros modelos de pérdida de función.

Un hemisferio de ratones P0 se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se usó para cada inmunoprecipitación de MYT1L como se describió anteriormente [21]. Las proteínas unidas se digirieron enzimáticamente y los péptidos se analizaron mediante análisis espectrométrico de masas (Fusion Orbitrap; Thermo Fisher Scientific).

Se aislaron células gliales de ratón a partir del cerebro anterior de CD1 de tipo salvaje (Jackson Laboratories) en P0 como se describe aquí [21]. Para cultivos neuronales primarios, se aislaron el hipocampo o la corteza de crías de ratón mutantes P0 Myt1l o de control como se publicó anteriormente [28]. Para la sobreexpresión o eliminación, las células se transdujeron con lentivirus que codifican las construcciones indicadas el día in vitro 3 (DIV3).

La generación de neuronas humanas se ha descrito previamente [29]. La inhibición de WNT y NOTCH se realizó complementando los medios desde el día 1 al día 4 con éster t-butílico de N-[N-(3,5-difluorofenacetil)-1-alanil]-S-fenilglicina 10 µM (DAPT; Sigma). , Tetrahidro-2-[4-(trifluorometil)fenil]-4H-tiopirano[4,3-d]pirimidina 15 µM (XAV939; Santa Cruz), o ambos. Para la maduración funcional, se sembraron células neuronales en cubreobjetos recubiertos con Matrigel o placas MEA recubiertas con laminina PEI (Axion) junto con glía primaria de ratón con cambios de medio cada 2 días durante una semana. Los siguientes cambios de medio se realizaron cada 3 a 4 días durante la duración del experimento.

A las mujeres embarazadas en el momento oportuno se les inyectó por vía intraperitoneal a E14,5 EdU (30 mg/kg de peso corporal) (Life Technologies). Después de 20 h se recogieron los cerebros embrionarios. El análisis de la fracción Q siguió prácticas previamente establecidas [6]. El número de células TBR2+ y SOX2+ se determinó en segmentos de la corteza media de 265 µm de ancho utilizando una macro Fiji desarrollada internamente. Todas las cuantificaciones se llevaron a cabo en posiciones anteroposteriores equivalentes entre genotipos.

Para el análisis del espesor cortical, se alinearon secciones de cerebro P0 entre genotipos utilizando puntos de referencia anatómicos subcorticales para orientación, y el espesor se midió en un ángulo de 45° desde la línea media dorsal. El análisis morfológico de las neuronas cultivadas se realizó con Fiji utilizando el complemento SNT [30, 31]. La localización nuclear FLAG-MYT1L se realizó en neuronas primarias de ratón en DIV 11 tras la sobreexpresión de las construcciones indicadas en DIV 3.

Los ratones se alojaron en un vivero con temperatura controlada mantenido en un ciclo de luz y oscuridad de 12 h y las pruebas se realizaron durante el ciclo de luz. Los procedimientos se realizaron en el Núcleo Neuroconductual Interdisciplinario de la Universidad de Heidelberg y fueron aprobados por el Regierungspräsidium de Karlsruhe (G-287/20, G-105/16).

Se prepararon bibliotecas de secuenciación de ARN siguiendo el protocolo dUTP [32] y las lecturas se asignaron a hg38 o mm10 usando STAR [33] y la expresión diferencial se determinó usando DESeq2 [34] (paquete R versión 1.28.1) con normalización del factor de tamaño y Wald. pruebas de significancia. Para los experimentos de RNA-Seq unicelulares, se extrajeron las cortezas prefrontales de ratones P0, se disociaron en células individuales y se codificaron con barras siguiendo el esquema ECCITE-Seq [35] siguiendo un protocolo publicado previamente [36]. Se empleó el kit de reactivos Chromium Single Cell 5' v1 para la preparación de la biblioteca. Las bibliotecas se secuenciaron utilizando un NovaSeq 6000 (Illumina). Los datos se analizaron con 10x Genomics Cell Ranger (versión 4.0.0) [37], Seurat (versión 4.0) [38] y Scanpy (versión 1.6.0) [39]. Las subpoblaciones de cada tipo de célula más afectadas por la mutación Myt1l se identificaron utilizando MELD (versión 1.0) [40] con parámetros Beta = 31 y KNN = 5. Se identificaron cambios significativos en las proporciones de tipos de células utilizando un método de arranque [41] basado en células normalizadas. números (FDR < 0,01 y abs(Log2FC) > 1). La expresión diferencial se realizó en estas subpoblaciones usando MAST (versión 1.16.0) [42] dentro de la función FindMarkers de Seurat (logfc.threshold = 0, min.pct = 0.05, todos los demás parámetros predeterminados). Las lecturas de secuenciación están disponibles en NCBI GEO GSE171327.

Se preparó la corteza prefrontal de ratones E18.5, P0 y de 3 meses de edad y se prepararon células individuales siguiendo el protocolo para la preparación del cultivo primario. Se utilizaron 300.000 células por animal para CUT&RUN utilizando protocolos publicados [43]. Las bibliotecas se prepararon con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext y se secuenciaron en NextSeq 2000 (Illumina). Los datos se analizaron utilizando el canal nf-core/cutandrun v1.0 (https://doi.org/10.5281/zenodo.5653535). Homer findMotifsGenome.pl se ejecutó en los archivos pico con los parámetros -size −75,75 -mask -mknown y el motivo MYT1L AAAGTTW (http://homer.ucsd.edu/homer/).

Se utilizaron ratones de 4 a 6 semanas de edad para generar cortes transversales de hipocampo que se parchearon como se describió anteriormente [44]. Para mediciones espontáneas de EPSC, las células piramidales se sometieron a tensión de -70 mV con una solución interna basada en K+ que contenía lo siguiente (en mM): 130 K-gluconato, 10 Na-gluconato, 10 HEPES, 10 fosfocreatina, 4 NaCl, 4 MgATP, 0,3 GTP y 0,5% biocitina. Para mediciones espontáneas de IPSC, las supuestas células piramidales se sujetaron con voltaje a 0 mV con una solución interna a base de Cs+ que contenía lo siguiente (en mM): 126 Cs-gluconato, 4 Cs-Cl, 10 HEPES, 10 fosfocreatina, 4 MgATP, 0,3 GTP y 2,5 QX-314 en presencia de CNQX (10 μM) y D-APV (50 μM). Los registros de corrientes sinápticas excitadoras en cultivos primarios de hipocampo en DIV11 se realizaron como se describe aquí [21] en presencia o ausencia de tetrodotoxina (TTX) 0,5 µM.

Las mediciones de MEA se realizaron utilizando el dispositivo multipocillo Maestro Pro con el software Axis Navigator y placas de 48 pocillos (todas de Axion Biosystems). Para tratamientos agudos, se añadió lamotrigina 10 µM (Targetmol) por pocillo y la placa se midió antes y 2 h después del tratamiento. Los datos se analizaron utilizando meaRtools [45].

Para abordar si las mutaciones de MYT1L pueden causar defectos complejos del desarrollo neurológico, generamos un modelo de ratón con una eliminación de 7 pb en el exón 6 de Myt1l (Figura complementaria S1A-F). Esta mutación de cambio de marco induce un codón STOP prematuro en el aminoácido (aa) 78, similar a un paciente con una mutación sin sentido en aa 75 en MYT1L humano [15]. La descendencia resultante mostró la reducción esperada en la proteína MYT1L de longitud completa en comparación con los controles (+/+) (Fig. 1A y Fig. Suplementaria S1G, H). Sin embargo, detectamos una isoforma MYT1L truncada, muy probablemente expresada a partir de una metionina interna en aa 99 (Figura complementaria S1G, I) (Tabla complementaria S1). Esta isoforma no logró translocarse al núcleo debido a la falta de la señal de localización nuclear y, por lo tanto, se espera que no sea funcional (Figura complementaria S1J, K). Los ratones Myt1l (+/-) son viables y fértiles, pero la eliminación homocigótica de Myt1l (-/-) resultó en letalidad posnatal (Fig. 1B). Esto muestra que MYT1L es esencial para la supervivencia y validó nuestro modelo de pérdida de función.

Los niveles de proteína de longitud completa de A MYT1L en lisados ​​cerebrales de ratones que albergan una mutación de la línea germinal de cambio de marco de 7 pb inducida por CRISPR en el exón 6 (primer exón codificante de proteína) de Myt1l después del nacimiento se normalizaron para controlar. Se muestran imágenes representativas de transferencia Western utilizando los anticuerpos indicados; n ≥ 6. B Gráfico circular de supervivencia de (+/−) x (+/−) crías al nacer (8 camadas P0; n = 12 (+/+, negro), 31 (+/−, verde azulado), 15 ( -/-, amarillo)) y después del destete (7 camadas P21; n = 15 (+/+), 17 (+/-), 0 (-/-)) indicaron que los mutantes homocigotos de Myt1l mueren después del nacimiento. C Sec. de ARN unicelular de la corteza prefrontal al nacer y probabilidad de observar enriquecimiento de células deficientes en MYT1L (+/-) y de control (+/+) en poblaciones de tipos de células específicas utilizando MELD. D Proporción de células deficientes en MYT1L (+/-) y de control (+/+) en los tipos de células indicados anotados en base a datos de referencia de [77]. * FDR <0,01 y abs(Log2FC) > 1. E Número de genes desregulados tras la mutación Myt1l (+/-) y (-/-) en los tipos de células indicados y los grupos MELD. Se muestran genes que están regulados hacia abajo (azul) o hacia arriba (rojo) tras la deficiencia de MYT1L con un cambio absoluto de log2 > 0,1 y p-adj < 0,05. F Perfiles de ocupación de todo el genoma de MYT1L endógeno en la corteza prefrontal de ratones de tipo salvaje determinados por CUT&RUN en P0 (n = 3). Los gráficos circulares G indican la distribución de los sitios unidos a MYT1L detectados en las regiones genómicas anotadas. H El motivo de unión al ADN de MYT1L (AAAGTT) está significativamente enriquecido en los sitios unidos. I Diagramas de caja de los cambios en la expresión génica en todo el genoma (todos) y en los genes objetivo de MYT1L (pico CUT&RUN ± 5 kb desde el sitio de inicio de la transcripción) para poblaciones de células individuales indicadas tras la eliminación de Myt1l en comparación con el control. Para scRNA-Seq n = 2 para Myt1l (-/-; 10503 células), (+/-; 13688 células) y (+/+; 12072 células), respectivamente. El gráfico de barras muestra los valores medios, se muestran puntos de datos de animales individuales, barras de error = SEM, prueba t no apareada en el panel A, prueba de Mann-Whitney en el panel I, ****p < 0,0001.

Para investigar los cambios en la composición celular y la expresión génica, realizamos una secuenciación de ARN unicelular (scRNA-Seq) de la corteza prefrontal al nacer (Fig. 1C – E y Fig. Suplementaria S2) (Tabla complementaria S2). No observamos pérdida o aparición de nuevos grupos de células, pero identificamos subpoblaciones específicas de mutantes de Myt1l calculando la probabilidad de que cada célula esté en un vecindario enriquecido con células de control o mutantes usando MELD [40] (Fig. 1C y Suplementario). Figura S2C, D). Solo se produjeron cambios menores en las proporciones de tipos de células entre ratones mutantes y de control (Fig. 1D y Fig. Suplementaria S2E), pero encontramos menos poblaciones de células Tbr2 y Sema3c, que marcan las neuronas migratorias recién formadas en la zona subventricular (SVZ) . Además, las interneuronas Cdca7+ se redujeron en ratones (-/-), mientras que las neuronas de la capa cortical I (Reln+) aumentaron. El análisis de los genes expresados ​​diferencialmente mostró que el agotamiento de MYT1L resultó en una regulación positiva global del gen que fue más pronunciada en mutantes homocigotos (Fig. 1E). Observamos una mayor expresión de muchos programas de genes no neuronales tras el agotamiento de MYT1L, incluso en las neuronas de la capa cortical (Figura complementaria S2F). Para identificar los genes diana de MYT1L, realizamos CUT&RUN [43] en ratones de tipo salvaje en el día embrionario (E) E18.5, el día postnatal (P) 0 (P0) y los 3 meses (adulto) (Fig. 1F, G y Fig. Suplementaria). .S2G, H) (Tabla complementaria S3). Encontramos una gran superposición de sitios unidos y un enriquecimiento del motivo de unión al ADN de MYT1L (AAAGTT) en diferentes etapas de desarrollo (Fig. 1H y Fig. Suplementaria S2I, J). La intersección de genes diana MYT1L con genes desregulados en P0 reveló una regulación positiva significativa dentro de diferentes poblaciones neuronales, como las poblaciones de células corticales Satb2 o Fezf2 (Fig. 1I y Fig. Suplementaria S2K). Esto subraya el papel de MYT1L como represor transcripcional y sugiere que, a pesar de la inducción de la identidad neuronal, las células mutantes de Myt1l no lograron silenciar programas de expresión génica inapropiados que causaron una identidad transcripcional confusa en las neuronas in vivo.

MYT1L puede mejorar la identidad neuronal in vitro al reprimir los reguladores negativos de la neurogénesis [21], como Notch y Wnt, que, tras una desregulación, podrían afectar la dinámica de diferenciación neuronal y la estructura del cerebro. Por lo tanto, realizamos una búsqueda de pulsos de EdU junto con la tinción conjunta para el marcador de proliferación, Ki67, para determinar la fracción de abandono (Q) de las células corticales que salen del ciclo celular durante un período de 20 h. De hecho, las células Ki67-EdU+ disminuyeron significativamente, lo que corresponde a una disminución en la fracción Q de ~37% en embriones Myt1l (-/-) en E15.5 (Fig. 2A). Las células madre neurales SOX2+ y los progenitores neurales TBR2+ se mantuvieron sin cambios en E15.5 (Figura complementaria 3A). Al nacer, las células madre SOX2+ aumentaron en los ratones Myt1l (+/-) y (-/-) (Fig. 2B), mientras que los progenitores TBR2+ no cambiaron. Esto imita la sobreexpresión del efector NOTCH Hes1 que aumenta la reserva de células madre después del nacimiento y da como resultado una corteza más delgada [46]. Por lo tanto, estudiamos la anatomía del cerebro de ratones con mutación Myt1l y descubrimos que el tamaño general del cerebro no cambió al nacer, mientras que el peso del cerebro era menor, lo que resultó en una mayor relación longitud-peso (Fig. 2C y Fig. Suplementaria S3B, C). Además, las cortezas eran ~10% (+/-) o ~15% (-/-) más delgadas que los controles, respectivamente (Fig. 2C y Fig. Suplementaria S3C). Estos resultados sugieren que la falta de represión de los programas antineurógenos perjudicó la neurogénesis, lo que a su vez podría causar anomalías estructurales del cerebro y explicar las malformaciones cerebrales encontradas en algunos pacientes [19].

A Imágenes representativas y cuantificaciones de células EdU+ después de un pulso de 20 h en E14.5 y fracción Q (proporción de EdU+Ki67− sobre todas las células EdU+) en la zona ventricular cortical (VZ) y la zona subventricular (SVZ) de Myt1l (+ /+, negro), (+/−, verde azulado) y (−/−, amarillo) ratones E15.5. Zona intermedia IZ, n ≥ 5, barra de escala 100 µm. B Cuantificación de células SOX2+ o TBR2+ en la corteza de ratones Myt1l (+/-) y (-/-) en comparación con el control (+/+) en P0 en la misma área de toda la corteza. Se muestran imágenes representativas de una ampliación de la zona ventricular y subventricular teñidas con los anticuerpos indicados. n ≥ 4, barra de escala 50 µm. C Estructura de los cerebros Myt1l (+/+), (+/−) y (+/−) en P0. Se muestran secciones representativas teñidas con NeuN y la cuantificación del espesor cortical absoluto y la longitud de la corteza normalizada por el peso del cerebro. n ≥ 5 para longitud cortical; secciones de n = 3 para espesor cortical, barra de escala 500 µm. Los gráficos de barras muestran valores medios, se muestran puntos de datos de réplicas biológicas individuales, barras de error = SEM, ANOVA unidireccional *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

A continuación, examinamos los efectos de la deficiencia de MYT1L a nivel molecular durante el desarrollo del cerebro utilizando RNA-Seq en masa de cortezas de ratón en E18.5 (que coincide con la expresión máxima de Myt1l en el cerebro de ratón (Figura complementaria S1A [11])), P0 (nacimiento), P22 (juvenil) y 3 meses (adulto). Encontramos varios cientos de genes expresados ​​diferencialmente, con distintos grupos de genes desregulados en el desarrollo temprano (E18.5 y P0) y tardío (P22 y adulto) (Fig. 3A y Fig. Suplementaria S4A) (Tabla complementaria S4). Muchos de los genes desregulados no se superpusieron con los objetivos MYT1L previamente anotados [21] o los objetivos MYT1L CUT&RUN (Fig. 1F y Fig. Suplementaria S2G), lo que implica que muchos cambios en las muestras masivas son indirectos. En muestras de cerebro heterocigotos, los genes diana MYT1L estaban regulados hacia arriba y hacia abajo; sin embargo, aproximadamente el 60% de los genes diana MYT1L directos estaban regulados hacia arriba tras la mutación homocigótica de Myt1l (Figura complementaria S4B). Esto está en línea con la regulación positiva de los genes diana MYT1L en neuronas corticales (+/-) y (-/-) según el análisis de células individuales (Fig. 1E), lo que sugiere que MYT1L actúa predominantemente como un represor durante el desarrollo neuronal. De acuerdo con la fracción Q disminuida en E15.5, la expresión génica en E18.5 reveló una regulación negativa de los términos GO asociados a la neurogénesis y una regulación positiva de la división celular (Fig. 3B). Además, observamos una regulación positiva de las firmas de expresión génica fetal temprana y una disminución concomitante de las firmas fetales tardías en E18.5 [47] (Fig. 3C y Fig. Suplementaria S4D). Esto sugiere que la deficiencia de MYT1L, como se observa en otros modelos de TEA en ratones [5], provoca retrasos en el desarrollo del cerebro. Observamos una regulación negativa continua de los términos GO neuronales y un aumento en la señalización y los términos no neuronales tras la mutación Myt1l en ratones adultos (Fig. 3B y Fig. Suplementaria S4C). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) destacó varias firmas del destino de células no neuronales entre los genes regulados positivamente e indicó un enriquecimiento general de genes implicados en la epilepsia, la esquizofrenia y el TEA entre los genes desregulados en los cerebros con mutaciones Myt1l [48, 49] ( Figura complementaria S4D, E). Curiosamente, los ratones que albergaban nuestra mutación del exón 6 de Myt1l mostraron una regulación hacia arriba y hacia abajo del gen que se superponía con los ratones haploinsuficientes de Chd8 [6], pero solo en parte con los ratones mutantes Myt1l del exón 15 [26] y del exón 9 [27] publicados recientemente (Figura complementaria). .S4F). Finalmente, descubrimos que los genes regulados positivamente en pacientes con TEA también lo están en nuestros ratones con deficiencia de MYT1L, mientras que los genes regulados negativamente en ratones con mutación Myt1l también están regulados negativamente en pacientes con TEA [5, 50] (Fig. 3D y Fig. Suplementaria S4G). En general, nuestros datos muestran que la deficiencia de MYT1L en ratones provoca retrasos en el desarrollo neurológico y la desregulación de la expresión genética, como se observa en pacientes con TEA.

Un mapa de calor de genes desregulados tras la mutación de Myt1l en todas las réplicas y etapas, escalado por gen (filas). B Términos seleccionados de ontología genética (GO) superior y valores p de genes que estaban regulados hacia abajo (azul) o hacia arriba (rojo) tras la mutación Myt1l en la corteza de ratones en comparación con el control en los momentos indicados durante el desarrollo. Los gráficos C GSEA muestran el agotamiento de los conjuntos de genes relacionados con el desarrollo neuronal del feto medio (azul) y el enriquecimiento de los conjuntos de genes relacionados con el desarrollo neuronal del feto temprano (rojo) entre genes desregulados en cerebros con mutaciones Myt1l en E18.5. NES: puntuación de enriquecimiento normalizado; FDR, tasa de descubrimiento falso. D Superposición de genes regulados hacia arriba o hacia abajo tras la mutación Myt1l en la corteza del ratón en E18.5 y P22 y genes que están regulados hacia arriba o hacia abajo en cerebros de pacientes con TEA determinados por GeneOverlap. Para el análisis de RNA-Seq n ≥ 5 E18.5, n ≥ 4 P0 para (+/+, negro), (+/−, verde azulado) y (−/−, amarillo), respectivamente; n = 6 P22, n ≥ 3 adultos para (+/+) y (+/−), respectivamente. La prueba de campo abierto E mostró que los mutantes Myt1l (+/-) cubrieron más distancia y pasaron más tiempo en las regiones centrales en comparación con los animales de control en P23; n = 25 para (+/+) y n = 29 para (+/−) de tres cohortes independientes. Los experimentos de la cámara social F mostraron una disminución específica de los machos en el tiempo que los mutantes Myt1l (+/-) dedicaron a explorar un ratón nuevo en comparación con los ratones de control a la edad de un mes; n = 10 para (+/+) y (+/−) de tres cohortes independientes. Los gráficos de barras muestran valores medios, se muestran puntos de datos de animales individuales, barras de error = SEM, prueba de Mann-Whitney **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, NS no significativo.

A continuación, realizamos análisis de comportamiento utilizando nuestro modelo de ratón Myt1l. Observamos una tendencia hacia una mayor vocalización en ratones posnatales tempranos con deficiencia de MYT1L, pero el número y el tipo de llamadas analizadas no cambiaron significativamente (Figura complementaria S5A). De acuerdo con los fenotipos de hiperactividad informados en varios pacientes con MYT1L [13,14,15,16, 51, 52], observamos un aumento de la locomoción en ratones adultos en sus jaulas, así como en ratones jóvenes en campo abierto y en laberinto elevado. pruebas (Fig. 3E y Fig. Suplementaria S5B – D). Los ratones mutantes pasaron aproximadamente un 70 % más de tiempo en las regiones centrales y los brazos abiertos en las dos últimas pruebas, respectivamente. Además, el comportamiento de crianza exploratoria aumentó significativamente en ratones mutantes (Figura complementaria S5D). Esto indica que los ratones con deficiencia de MYT1L son menos ansiosos, un fenotipo informado en otros modelos de ratones con TEA [53, 54]. También observamos una disminución significativa en los eventos de entierro y aseo de mármol, que se utilizan para evaluar comportamientos repetitivos pero que también representan una disminución de comportamientos similares a la ansiedad (Figura complementaria S5D, F). Finalmente, se realizaron experimentos en cámara social para investigar el comportamiento social de nuestros ratones mutantes Myt1l. Todos los animales mostraron la preferencia esperada por investigar cámaras con un compañero de camada familiar en lugar de cámaras vacías. Sin embargo, mientras que los ratones mutantes Myt1l de tipo salvaje y hembra pasaron más tiempo explorando la cámara con un ratón desconocido recién agregado, los machos con deficiencia de MYT1L no exhibieron esta preferencia esperada por la novedad social (Fig. 3F y Fig. Suplementaria S5E). En resumen, el agotamiento de Myt1l provoca varios cambios de comportamiento sorprendentes en las pruebas utilizadas para modelar el comportamiento relacionado con el TEA, incluida la hiperactividad que se encontró en ratones machos y hembras y déficits sociales específicos de los machos.

Para analizar el papel de MYT1L en las neuronas humanas, diseñamos células madre embrionarias humanas (hESC) con un alelo knockout condicional heterocigoto del exón 7 de MYT1L (+/fl) (Fig. 4A y Fig. Suplementaria S6). Las hESC MYT1L (+/fl) se dirigieron hacia neuronas humanas eléctricamente maduras mediante diferenciación mediada por el factor de transcripción NGN2 [29]. Esto permite estudiar los procesos sinápticos y de desarrollo relacionados con los trastornos neurológicos de manera condicional [55,56,57]. La eliminación de MYT1L (+/-) mediada por Cre resultó en una reducción de proteínas de ~50%, imitando la haploinsuficiencia de MYT1L encontrada en pacientes (Fig. 4B, Fig. Suplementaria S6G). Primero, evaluamos los efectos transcripcionales del agotamiento de MYT1L en comparación con los controles isogénicos transducidos con Δcre en los momentos de maduración temprana y tardía (Tabla complementaria S5). Las neuronas mutantes MYT1L mostraron una disminución en los términos neuronales de GO y un enriquecimiento de genes implicados en la epilepsia, la esquizofrenia y el TEA entre los genes desregulados [48, 49] (Fig. 4C y Fig. Suplementaria S7A). Los términos GO asociados con genes diferencialmente regulados positivamente se superpusieron fuertemente entre nuestros modelos de ratón y humanos (Figura complementaria 7B) (Tabla complementaria S6), lo que indica efectos conservados. En general, el agotamiento de MYT1L resultó en una activación genética más fuerte temprano (semana 1) y tardía (semana 6) después de la inducción neuronal (Fig. 4D y Fig. Suplementaria S7C). El motivo de unión al ADN de MYT1L (AAAGTT) se enriqueció en genes regulados positivamente tras el agotamiento de MYT1L (Fig. 4E y Fig. Suplementaria S7D, E). Varios factores de transcripción que regulan el destino de las células no neuronales, como el PRRX1 específico del mesodermo o el regulador del interruptor de glía SOX9 [58, 59], albergan motivos MYT1L y estaban regulados positivamente en neuronas deficientes en MYT1L (Fig. 4F). GSEA reveló una regulación positiva de los programas de expresión de genes no neuronales, como el destino de las células musculares, tras el agotamiento de MYT1L (Figura complementaria S7F). El análisis de la vía de ingenio (IPA) confirmó que los programas de desarrollo inapropiados, como la miogénesis y la cardiogénesis, se activaron después de la mutación MYT1L, lo que sugiere que MYT1L los reprime continuamente (Fig. 4G y Fig. Suplementaria S7G). Por otro lado, los factores de transcripción neuronal como VAX2 o EN1 que no contienen motivos MYT1L en su promotor mostraron una expresión disminuida después de una semana, pero en comparación con los controles exhibieron un aumento inesperado de la expresión en la semana seis (Fig. 4F). Este patrón de expresión se reflejó en las vías involucradas en la diferenciación y función neuronal, incluida la sinaptogénesis y la señalización de calcio, que inicialmente se reprimieron pero luego aumentaron en las neuronas con deficiencia de MYT1L (Fig. 4G y Fig. Suplementaria S7G). Es importante destacar que nuestros hallazgos con respecto a la desregulación de genes neuronales se recapitularon en neuronas derivadas de un clon hESC MYT1L (+/fl) adicional diseñado de forma independiente (Figuras complementarias S6 y S7). Sorprendentemente, el retraso en la expresión del gen neuronal no afectó la complejidad de las neuronas después de diez días o seis semanas de neurogénesis inducida (Figura complementaria S8). Durante la reprogramación neuronal de fibroblastos de ratón, MYT1L promovió el destino neuronal al reprimir genes antineurógenos como Id3, así como los miembros de las vías WNT y NOTCH [21]. Aquí, observamos una mayor expresión de estos genes en neuronas humanas con deficiencia de MYT1L durante la inducción neuronal (Fig. 4F). La aplicación combinada de inhibidores químicos dirigidos a las vías WNT y NOTCH restauró la proteína TUJ1 para controlar los niveles y normalizó parcialmente los cambios en la expresión génica en mutantes MYT1L según las mediciones de RNA-Seq, particularmente al disminuir la expresión de genes que se regulan positivamente tras el agotamiento de MYT1L (Fig. 4H y Figura complementaria S9A, B) (Tabla complementaria S7). Además, identificamos varios factores de transcripción proneuronales que normalmente alcanzan su punto máximo temprano durante la neurogénesis inducida y que se regulaban negativamente en las neuronas mutantes MYT1L en la semana uno, pero se regulaban positivamente en la semana seis (Figura complementaria S9C). La expresión de estos factores podría normalizarse en neuronas deficientes en MYT1L mediante la inhibición de WNT y NOTCH en la semana uno (Figura complementaria S9D). En general, esto indica que la eliminación heterocigótica de MYT1L durante la neurogénesis inducida por humanos causa la desregulación de genes asociados al autismo y la activación de genes diana no neuronales que resultan en retrasos en la neurogénesis mediados al menos en parte por el aumento de la señalización WNT y NOTCH.

Un esquema de la eliminación heterocigótica condicional de MYT1L durante la neurogénesis humana inducida por factores de transcripción. B Cuantificación por transferencia Western de células 7 días (1 semana) después de la inducción de la neurogénesis normalizada con respecto al control. Se muestran imágenes representativas de transferencia Western utilizando los anticuerpos indicados; n = 3. C Los genes desregulados en neuronas mutantes MYT1L 43 días (6 semanas) después de la inducción de la neurogénesis normalizada para el control mostraron una superposición significativa con genes relacionados con la epilepsia, la esquizofrenia y el TEA determinado mediante la prueba exacta de Fisher. D Gráfico de volcán de genes expresados ​​diferencialmente en neuronas humanas empobrecidas en MYT1L después de una maduración durante una semana en comparación con controles isogénicos. Se destacan los genes que estaban regulados hacia abajo (azul) o hacia arriba (rojo) tras el agotamiento de MYT1L con un cambio absoluto de log2 > 0,2 y p-adj < 0,1. E El motivo de unión al ADN de MYT1L, AAAGTT, se enriqueció significativamente en genes regulados positivamente en el panel D. F Los genes desregulados seleccionados tras el agotamiento de MYT1L se muestran como un cambio de veces hacia abajo (azul) o regulados hacia arriba (rojo) en comparación con el control isogénico y el número de motivos MYT1L en los respectivos Se muestran los promotores. BE muestra datos para el clon representativo 1. G Análisis de ruta de ingenio (IPA) de genes expresados ​​diferencialmente en neuronas inducidas por humanos empobrecidas en MYT1L. El estado de activación (rojo) o inhibición (azul) de una vía o función biológica está representado por una puntuación z (prueba exacta de Fisher de cola derecha). Los resultados se muestran para dos clones, 1 y 6 semanas después de la neurogénesis humana inducida por el factor de transcripción. n = 4 (clon 1) o n = 5 (clon 2) para (+/fl) y (+/−), respectivamente. H Los niveles reducidos de proteína TUJ1 en neuronas humanas inducidas por MYT1L empobrecidas en el día 7 se pueden restaurar mediante la inhibición de WNT y NOTCH a través de XAV939 y DAPT con n = 4 (clon 1). Los gráficos de barras muestran valores medios, se muestran puntos de datos de réplicas biológicas individuales, barras de error = SEM, prueba t no apareada en el panel B y H, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Para investigar si la haploinsuficiencia de MYT1L afecta la función neuronal en células humanas, estudiamos las propiedades electrofisiológicas de las neuronas MYT1L (+/-) a nivel de población después de seis semanas de maduración utilizando una matriz de electrodos múltiples (MEA) [60, 61]. Inesperadamente, observamos que la activación de picos se duplicó y la actividad de activación simultánea de la red se triplicó en neuronas mutantes MYT1L humanas en comparación con los controles (Fig. 5A). La actividad electrofisiológica alterada se correlacionó directamente con el agotamiento de la proteína MYT1L, ocurrió tan pronto como tres semanas después de la inducción neuronal y se mantuvo hasta el final de un experimento a largo plazo en la semana 15 (Figura complementaria S10A-C). El fenotipo electrofisiológico podría recapitularse en un clon de hESC MYT1L (+/fl) diseñado de forma independiente (Figura complementaria S10D). A continuación, probamos si estos cambios funcionales se conservaban en las neuronas primarias de ratón. Con ese fin, investigamos las propiedades electrofisiológicas de neuronas del hipocampo cultivadas derivadas de ratones mutantes Myt1l y de control utilizando MEA. Recapitulando nuestros hallazgos en neuronas MYT1L (+/-) humanas, observamos un aumento de la activación y la hiperactividad de la red. Estos efectos aumentaron con el agotamiento de MYT1L, con un aumento promedio de disparo de picos de ~700% (-/-) y ~400% (+/-) en comparación con el control (Fig. 5B y Fig. Suplementaria S11A). Es de destacar que la sobreexpresión de MYT1L99-1187 en neuronas de tipo salvaje no alteró la actividad electrofisiológica en MEA, lo que descarta un posible efecto negativo dominante de la isoforma MYT1L truncada, lo que confirma aún más que nuestros ratones mutantes Myt1l son un modelo de pérdida de función (Figura complementaria .S11B). También se pudo observar una mayor actividad de activación de MEA en neuronas primarias derivadas de la corteza de ratones con deficiencia de MYT1L al nacer, lo que indica que los defectos no se limitan a regiones cerebrales específicas, sino que afectan al menos a dos áreas implicadas en el TEA [62] (Figura complementaria S11C ). Para correlacionar la hiperactividad de la red observada con la actividad sináptica de células individuales, realizamos grabaciones de pinzamiento de parche. De acuerdo con la hiperactividad de la red observada, la amplitud y frecuencia de las corrientes postsinápticas excitadoras espontáneas (EPSC) y de las EPSC en miniatura (mEPSC; registradas en presencia de tetrodotoxina (TTX)) aumentaron en neuronas primarias de ratón cultivadas con deficiencia de MYT1L (Figura complementaria .S11D,E), respectivamente. Al igual que en el modelo humano, no observamos cambios significativos en la morfología neuronal de las neuronas primarias cultivadas con deficiencia de MYT1L (Figura complementaria S11F). También realizamos registros electrofisiológicos de cortes cerebrales de neuronas piramidales ubicadas en la región CA1 del hipocampo de ratones de un mes de edad. De acuerdo con nuestros datos in vitro, observamos una mayor frecuencia de EPSC espontánea en mutantes Myt1l en comparación con los controles (Fig. 5C). Las propiedades intrínsecas, como el potencial de membrana en reposo y las características del potencial de acción evocado, parecieron sin cambios (Figura complementaria S12A). La frecuencia de las corrientes postsinápticas inhibidoras espontáneas (sIPSC, registradas en presencia de CNQX y D-APV) aumentó en las neuronas piramidales deficientes en MYT1L, lo que indica que el aumento de la excitación no fue el resultado de una disminución de la inhibición (Figura complementaria S12B). Nuestros experimentos muestran que el agotamiento continuo de MYT1L perjudica la función neuronal y da como resultado un fenotipo de hiperactividad electrofisiológica inesperado en neuronas humanas y de ratón.

Un aumento de la actividad de la red neuronal espontánea medida mediante una matriz de electrodos múltiples (MEA) en neuronas con deficiencia de MYT1L (+/-; verde azulado) en comparación con el control (+/fl, negro) 6 semanas después de la neurogénesis inducida. Se muestran gráficos ráster representativos y cuantificaciones de picos y picos de red. B Hiperactividad de la red medida por MEA para neuronas del hipocampo control (+/+, negro) y mutante Myt1l (+/-; verde azulado y -/-; amarillo) en cultivo el día in vitro 11 (DIV11). Se muestran cuantificaciones y gráficos ráster representativos. C Aumento de las corrientes postsinápticas excitadoras espontáneas (sEPSC) de las neuronas piramidales CA1 en cortes agudos de cerebro de ratón. Se muestran trazas representativas, cuantificación y distribuciones acumulativas, los gráficos de barras muestran valores medios con el número de células parcheadas o pocillos MEA de réplicas biológicas indicadas, barras de error = SEM, prueba de Mann-Whitney en los paneles A y C, ANOVA unidireccional en el panel B, *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Observamos fenotipos de hiperactividad de redes electrofisiológicas similares basados ​​en mediciones de MEA en neuronas primarias de ratón y humanas derivadas de células madre tras la mutación MYT1L, lo que indica un mecanismo molecular subyacente conservado. Dado que se observó la activación de genes diana no neuronales tras la mutación MYT1L en modelos humanos y de ratón, esto podría contribuir a la superposición de fenotipos. Para identificar dichos objetivos, analizamos genes que: (i) estaban unidos a MYT1L in vivo según lo determinado por CUT&RUN (Fig. 1F y Fig. Suplementaria S2G) (Tabla complementaria S3); (ii) se desregularon en neuronas primarias inducidas por ratones o humanos tras la eliminación heterocigótica de MYT1L determinada por RNA-Seq (Tablas complementarias S5 y 8); (iii) contribuyó a la regulación positiva de términos no neuronales basados ​​en IPA (Fig. 4 y Fig. Suplementaria S4 y 7); y (iv) se expresaron poco en el cerebro en comparación con otros tejidos, según conjuntos de datos de expresión pública [63]. Sorprendentemente, el 78% (30 de 38) de estos objetivos no neuronales se regularon positivamente tras el agotamiento de MYT1L en neuronas de ratón y humanas (Fig. 6A y Fig. Suplementaria S13A). El principal objetivo regulado positivamente es TFAP2B, que, tras una mutación, puede causar el síndrome de Char, caracterizado por anomalías faciales, ductales y de las manos [64]. Curiosamente, algunos pacientes con mutaciones MYT1L presentan dismorfismos faciales leves [19, 65]. Además, encontramos un aumento de casi el doble del canal de sodio cardíaco dependiente de voltaje SCN5A, que tras una mutación puede causar el síndrome de QT largo [66], entre los 10 principales genes diana regulados positivamente. SCN5A mostró una expresión basal baja en neuronas humanas y de ratón, y una mayor expresión en neuronas deficientes en MYT1L podría alterar las propiedades electrofisiológicas. MYT1L permanece expresado en neuronas maduras, lo que sugiere que también funciona en neuronas posmitóticas (Figura complementaria S1A). Por lo tanto, preguntamos si la sobreexpresión (OE) de Myt1l en neuronas posmitóticas con deficiencia de MYT1L podría restaurar la represión de genes diana, como Scn5a. Myt1l OE aumentó significativamente la expresión del marcador neuronal Tuj1 en comparación con los controles de GFP OE (Fig. 6B y Fig. Suplementaria S13B, C). Es importante destacar que Myt1l OE disminuyó la expresión de genes diana que estaban regulados positivamente en las neuronas mutantes MYT1L, específicamente Hes1 y Scn5a (Fig. 6C). Sorprendentemente, descubrimos que Myt1l OE también restauró la actividad de la red neuronal a niveles de control (Fig. 6D). Estos resultados sugieren que la desregulación continua de la expresión genética en las neuronas posmitóticas causada por la mutación MYT1L contribuye a los fenotipos de hiperactividad electrofisiológica, y que estos podrían restaurarse incluso después de que se complete el neurodesarrollo. Para probar si la regulación positiva de SCN5A causó el fenotipo de hiperactividad electrofisiológica, realizamos una eliminación de SCN5A mediada por shRNA en neuronas primarias de ratón e inducidas por humanos, lo que redujo los niveles de SCN5A en un 80%, y medimos la actividad de la red neuronal utilizando MEA (Figura complementaria S13D). Sorprendentemente, la eliminación de Scn5a redujo la hiperactividad de la red neuronal en (+/-) y (-/-) neuronas primarias de ratón a niveles de tipo salvaje (Fig. 6E). Esto podría recapitularse mediante la eliminación de SCN5A en neuronas inducidas por humanos MYT1L (+/-) (Fig. 6G), lo que indica que la regulación positiva de SCN5A contribuye al menos en parte a la hiperactividad de la red electrofisiológica en neuronas mutantes MYT1L humanas y de ratones. Para encontrar una posible intervención terapéutica, decidimos probar si lamotrigina, un bloqueador de los canales de sodio y un fármaco antiepiléptico aprobado por la FDA [67, 68], podría rescatar los fenotipos inducidos por la deficiencia de MYT1L. De hecho, la aplicación aguda de lamotrigina normalizó la hiperactividad de la red electrofisiológica de neuronas deficientes en MYT1L tanto humanas como de ratón hacia niveles de control (Fig. 6F, H). Finalmente, para estudiar si la hiperactividad de la red neuronal contribuye a los fenotipos de comportamiento observados tras la mutación Myt1l y para probar si estos también son susceptibles de intervención farmacológica in vivo, inyectamos lamotrigina a ratones. Descubrimos que el tratamiento agudo con lamotrigina en ratones con mutación Myt1l normalizó el comportamiento de ansiedad e hiperactividad en la prueba de campo abierto, así como la locomoción y la crianza en observaciones de jaulas domésticas, hacia ratones de control no tratados (Fig. 6I y Fig. Suplementaria S13E). En general, estos resultados muestran que, además de los defectos del desarrollo neurológico, la mutación MYT1L provoca una regulación positiva de genes no neuronales y una hiperactividad de la red neuronal en neuronas humanas y de ratones. El tratamiento agudo con lamotrigina en neuronas posmitóticas y ratones adultos rescató tanto la hiperactividad de la red electrofisiológica como los fenotipos de comportamiento probados (Fig. 6J), lo que indica que los efectos electrofisiológicos contribuyen, al menos en parte, a la alteración del comportamiento en ratones. Por lo tanto, la mutación MYT1L no sólo afecta el desarrollo, sino que también afecta la función neuronal y el comportamiento en la edad adulta, lo que sugiere que los tratamientos dirigidos también pueden beneficiar a los pacientes en etapas posteriores del desarrollo.

A Los genes diana MYT1L no neuronales desregulados en neuronas humanas con deficiencia de MYT1L (semana 6) y neuronas primarias de ratón en el día in vitro 11 (DIV11) incluyen el canal de sodio cardíaco SCN5A. La desregulación de la expresión génica basada en RNA-Seq se muestra como un cambio en comparación con el control, n = 4 (humano) para (+/fl) y (+/−), n = 3 (ratón) para (+/+) y (+/-), respectivamente. Los datos de expresión de tejidos del portal GTEx se muestran como puntuación z. B Cronología esquemática para los experimentos de rescate genético y farmacológico en hipocampo primario de ratón y cultivos neuronales humanos inducidos. C Regulación negativa significativa de los genes diana de MYT1L Scn5a y Hes1 en cultivos primarios de hipocampo de ratón con deficiencia de MYT1L en DIV11 tras la sobreexpresión (OE) de Myt1l en DIV3 en comparación con GFP OE determinada por qRT-PCR. Los gráficos muestran diagramas de dispersión de columnas con la mediana mostrada; n ≥ 8. D La hiperactividad de la red en neuronas primarias de ratón deficientes en MYT1L se puede rescatar en DIV11 mediante la sobreexpresión de Myt1l en neuronas posmitóticas en DIV3. E La eliminación de Scn5a mediante la expresión de shRNA en neuronas posmitóticas en DIV3 redujo la frecuencia de picos de las neuronas Myt1l (+/-) y (-/-). F La hiperactividad en neuronas primarias de ratón deficientes en MYT1L también se puede rescatar mediante la aplicación aguda de lamotrigina 10 μM en DIV11. La eliminación de G SCN5A con shRNA en neuronas inducidas por humanos resultó en una frecuencia de picos reducida. H El aumento de la activación de picos tras la mutación MYT1L se normalizó hacia el control mediante la aplicación aguda de lamotrigina 10 μM en neuronas humanas inducidas en la semana 6. I Las pruebas de campo abierto mostraron que los mutantes Myt1l (+/-) cubrieron más distancia en las regiones centrales en comparación con los animales de control en P23 y la aplicación aguda de 20 mg/kg de lamotrigina pueden normalizar estos fenotipos de hiperactividad. Vehículo: n = 23 para (+/+) y n = 29 para (+/−), lamotrigina: n = 19 para (+/+) y n = 23 para (+/−) datos de tres cohortes independientes. J Resumen esquemático de las funciones clave de MYT1L durante las etapas tempranas y posnatales del desarrollo y los defectos tras la pérdida de MYT1L que pueden compensarse en parte mediante intervención genética y farmacológica en ambas etapas. Los gráficos de barras muestran valores medios con el número de pocillos MEA de réplicas biológicas indicadas o puntos de datos de animales individuales, barras de error = SEM, prueba de Mann-Whitney en el panel C, ANOVA de dos vías en el panel D–I, *p < 0,05, * *p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, NS no significativo.

A diferencia de la mayoría de los reguladores de la cromatina asociados a enfermedades neuropsiquiátricas, el factor de transcripción MYT1L se expresa específicamente en prácticamente todas las neuronas y permanece expresado durante toda la vida [11, 12]. Sin embargo, aún no se comprende bien si las mutaciones de MYT1L pueden causar enfermedades neuropsiquiátricas y cómo. En este estudio, presentamos evidencia de que la haploinsuficiencia de MYT1L es suficiente para causar fenotipos asociados con NDD y ASD en neuronas humanas, así como en modelos de ratón, debido a la falta de represión de genes diana, lo que resulta en (i) retrasos durante la neurogénesis del desarrollo y (ii) sinápticos. Mal funcionamiento en las neuronas maduras. La deficiencia de MYT1L en nuestros modelos humanos y de ratón provocó una desregulación significativa de genes asociados con la epilepsia, la esquizofrenia y el TEA, que se han diagnosticado en pacientes portadores de mutaciones de MYT1L [13,14,15,16]. También encontramos que los cambios en la expresión genética en cerebros de ratones con mutaciones de Myt1l se parecían directamente a los observados en cerebros de pacientes con TEA, lo que demuestra que la deficiencia de MYT1L puede conducir a perfiles transcripcionales asociados con TEA. Los fenotipos adicionales relacionados con el TEA y los NDD asociados a MYT1L incluyen retrasos en el desarrollo neurológico y cambios en la anatomía del cerebro. Utilizando el análisis transcriptómico, observamos una dinámica de maduración alterada en neuronas humanas con deficiencia de MYT1L tras la diferenciación neuronal mediada por factores de transcripción in vitro y una neurogénesis alterada en la corteza prefrontal de ratones mutantes Myt1l in vivo. Incluso en E18.5, los ratones con mutación Myt1l mostraron activación de programas de expresión génica fetal temprana y regulación negativa de programas fetales medios, lo que también se ha descrito en otros modelos de TEA [5]. Estudios anteriores demostraron que el agotamiento agudo de Myt1l o del miembro de la familia estrechamente relacionado Myt1 mediante el tratamiento con shRNA alteraba la neurogénesis en el útero al reprimir la expresión de Hes1 y la señalización de Notch (21, 69). Aquí, ampliamos estos hallazgos al mostrar que la mutación de la línea germinal Myt1l perjudicó la salida del ciclo celular de los progenitores corticales durante el desarrollo y aumentó la cantidad de células madre neurales SOX2+ en la SVZ al nacer, lo que se asemeja a los fenotipos de sobreexpresión de Hes1 [46]. De hecho, la inhibición química combinada de WNT y NOTCH podría restaurar la inducción temprana de genes proneuronales en neuronas inducidas por humanos. Esto confirma la neurogénesis deteriorada tras la deficiencia de MYT1L y podría explicar el adelgazamiento de la corteza observado en ratones con mutación de Myt1l y los retrasos en el desarrollo neurológico en modelos humanos y de ratón.

Una limitación de nuestro estudio es que modelamos solo mutaciones de cambio de marco que se predice que darán como resultado codones STOP prematuros de MYT1L tanto humano como de ratón, similar a un paciente informado con una mutación sin sentido en aa 75 [15]. Nuestro modelo de ratón presentó un cambio de marco en el exón 6 [70] que generó isoformas de la proteína MYT1L no funcionales a las que les faltaban dominios esenciales como la señal de localización nuclear, mientras que la eliminación condicional del exón 7 en nuestro modelo humano resultó en una descomposición del ARN mediada sin sentido. Es de destacar que ambos modelos exhibieron fenotipos electrofisiológicos y desregulación genética similares, lo que sugiere que la pérdida de función da como resultado defectos superpuestos independientemente del tipo de mutación. En particular, dos estudios recientes describen modelos adicionales de ratones Myt1l; Chen et al. generó una mutación de cambio de marco en el exón 15 [26], y Kim et al. utilizó un mutante de escisión del exón 9 [27]. Los tres modelos tienen en común que la eliminación homocigótica de Myt1l produce letalidad posnatal y alteración de la morfología cerebral, lo que enfatiza el papel crucial de MYT1L para el desarrollo. Además, los tres estudios encontraron fenotipos conductuales que incluyen hiperactividad. En línea con nuestro estudio, Kim et al. informó una disminución de la ansiedad. Chen et al. informaron un comportamiento social deteriorado específico de los hombres, que también encontramos en nuestro modelo, aunque utilizamos diferentes ensayos y etapas de desarrollo. Sin embargo, los tres modelos de ratón con mutación Myt1l exhiben distintos defectos de expresión genética y desarrollo neurológico. A diferencia de nuestro estudio, Chen et al. informan un aumento de la fracción Q y una disminución de las células madre neurales SOX2+ en ratones con deficiencia de Myt1l en E14.5 y sugirieron que MYT1L actúa principalmente como un activador transcripcional. Sin embargo, en una preimpresión reciente, los mismos autores encontraron que MYT1L se une y reprime promotores y potenciadores de genes implicados en programas tempranos de desarrollo neuronal [71]. Aquí, utilizando transcriptómica unicelular, mostramos que los genes unidos a MYT1L se activan en las neuronas corticales tras la pérdida de MYT1L, lo que respalda su papel como represor. En línea con esto, tanto Chen et al. y nuestro estudio encontró una mayor expresión de firmas genéticas tempranas del desarrollo neurológico en etapas posteriores del desarrollo. En particular, todos los estudios informan una superposición significativa de genes desregulados con conjuntos de genes de TEA. Por lo tanto, si bien las diferencias entre estos tres modelos de ratón Myt1l podrían reflejar la naturaleza distinta de las mutaciones, los antecedentes genéticos del ratón y las condiciones experimentales, su superposición enfatiza el importante papel de MYTL para el desarrollo neurológico. Además de las variantes de pérdida de función, se han informado varias variantes de novo sin sentido, indeles y duplicaciones y eliminaciones genómicas que abarcan MYT1L en individuos con enfermedades neuropsiquiátricas [19, 65]. Dado que los pacientes con MYT1L muestran diversos fenotipos, incluidas macro y microcefalia, y se les diagnostican diferentes trastornos neuropsiquiátricos como TEA y esquizofrenia, se necesitarán estudios futuros para aclarar cómo mutaciones específicas o antecedentes genéticos afectan estos fenotipos mediante la ingeniería de células madre humanas y de ratón adicionales. modelos o generando neuronas derivadas de pacientes a partir de células madre pluripotentes inducidas.

Además de la desestabilización de la identidad de las células neuronales, que se manifestó como cambios en la expresión genética y retrasos en la neurogénesis, observamos fenotipos electrofisiológicos sorprendentes en las neuronas con deficiencia de MYT1L. Inesperadamente, las neuronas primarias de ratón y humanas inducidas mostraron un aumento de tres a cuatro veces en la actividad de la red neuronal, respaldado por un aumento en la amplitud de las sEPSC y la frecuencia de las mEPSC. Dado que la frecuencia de sIPSC aumentó en las neuronas piramidales deficientes en MYT1L, es probable que el aumento de la actividad de la red no sea causado por una disminución de la inhibición en nuestro modelo. Sin embargo, en ratones Myt1l (-/-) recién nacidos, observamos un ligero aumento en la fracción de neuronas de la capa cortical I junto con una disminución de las poblaciones de interneuronas Cdca7+ según el análisis de células individuales. Por lo tanto, el efecto de las mutaciones de MYT1L en las neuronas inhibidoras sigue siendo difícil de alcanzar y requiere estudios futuros. Los fenotipos de la red podrían explicarse por múltiples factores, como cambios en la morfología neuronal o la densidad de sinapsis, así como mecanismos generales que regulan la liberación de neurotransmisores, incluida la desregulación de los canales de sodio y calcio dependientes de voltaje [72,73,74]. Curiosamente, la regulación positiva de canales que normalmente no se expresan específicamente en las neuronas, como SCN5A, también podría afectar la transmisión sináptica normal en las neuronas mutantes MYT1L. Por lo tanto, probamos si la sobreexpresión de MYT1L, la eliminación de SCN5A mediada por shRNA o el tratamiento con lamotrigina, que bloquea los canales de sodio y calcio [67, 68], podrían rescatar la hiperactividad de la red inducida por la mutación de MYT1L. Sorprendentemente, la sobreexpresión de MYT1L disminuyó la expresión de genes diana como Scn5a y Hes1 en neuronas de ratón posmitóticas con deficiencia de MYT1L, y la sobreexpresión de MYT1L y la eliminación de SCN5A rescataron fenotipos de hiperactividad de la red electrofisiológica. Además, la aplicación aguda de lamotrigina normalizó no solo los fenotipos de hiperactividad de la red de neuronas posmitóticas humanas y de ratón con deficiencia de MYT1L, sino también varios fenotipos de hiperactividad conductual observados en ratones. Esto sugiere que fenotipos específicos asociados a la haploinsuficiencia de MYT1L pueden rescatarse mediante intervención genética o fármacos de molécula pequeña incluso en etapas más avanzadas del desarrollo.

En general, presentamos la primera evidencia de que las mutaciones de MYT1L desestabilizan el destino y la función de las células neuronales y son suficientes para causar fenotipos asociados a TEA en modelos humanos y de ratón. Por lo tanto, la imposibilidad de silenciar la expresión de genes no neuronales en las neuronas representa un mecanismo novedoso que, al menos en parte, podría contribuir a la etiología del TEA. MYT1L es un factor de transcripción único asociado a enfermedades del neurodesarrollo que se expresa específicamente en prácticamente todas las neuronas a lo largo de la vida. Por lo tanto, es tentador especular que la represión activa y permanente de programas no neuronales es una vía conservada evolutivamente crítica para la prevención de trastornos cerebrales. Curiosamente, los niveles de MYT1L disminuyen durante el envejecimiento tanto en ratones como en humanos (Figura complementaria S1A), y recientemente se ha sugerido que la pérdida de identidad de las células neuronales desempeña un papel en los modelos de la enfermedad de Alzheimer [75, 76], lo que sugiere que la neurodegeneración también podría ser regulado por el nuevo mecanismo mediado por MYT1L presentado aquí. Finalmente, mostramos que la hiperactividad inesperada de la red electrofisiológica ante la deficiencia de MYT1L en neuronas posmitóticas de ratones y humanos, y los fenotipos de comportamiento asociados en ratones, pueden ser atacados de manera aguda por el fármaco aprobado lamotrigina, lo que podría brindar una oportunidad para intervenciones terapéuticas.

Todos los datos están disponibles en el texto principal o en los materiales complementarios. GSEA se realizó como se describe anteriormente. Los datos de secuenciación de próxima generación están disponibles en NCBI GEO GSE171327. Se puede acceder a los datos de espectrometría de masas en PRIDE PXD037867.

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Descargar referencias

Agradecemos a L. Meng y M. Wernig su apoyo para generar y compartir generosamente ratones con deficiencia de MYT1L. Agradecemos a I. Everlien por el asesoramiento técnico y a K. Oliveras Mate por el análisis inicial de la transcripción. Agradecemos a las instalaciones centrales de DKFZ, específicamente a la Instalación Central de Genómica y Proteómica (A. Schulz), al scOpenLab (P. Mallm), a los cuidadores del Centro de Investigación Preclínica (S. So) y a las instalaciones de Microscopía Ligera (M. Brom, D. Krunic). También agradecemos a B. Kurpiers y C. Pitzer del Núcleo Neuroconductual Interdisciplinario de la Universidad de Heidelberg por su excelente apoyo. Agradecemos a C. Schaaf, D. Odom, F. Winkler, L. Steinmetz, H. Ahlenius, A. Agarwal y a los miembros del laboratorio Mall, incluido T. Kanamaru, por sus ideas y debates.

Este trabajo fue apoyado por fondos de Chica y Heinz Schaller Stiftung, Beca para jóvenes investigadores NARSAD de 2019, DFG SFB1158-SO2, y una Beca Fritz Thyssen de 2021 para CAc y CellNetworks (EXC81), Beca para jóvenes investigadores de NARSAD 2020, DFG 504019642, ERC StG No 804710 y Hector Stiftung II gGmbH a MM. DP ha sido apoyado por el DFG SFB1324. El DAAD/ANID concedió becas a JC (57451854/62180003) y la Helmholtz International Graduate School a BW, JFT, BL, JT y MS. Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Ignacio L. Ibarra

Dirección actual: Instituto de Biología Computacional, Helmholtz Zentrum München, Centro Alemán de Investigación para la Salud Ambiental, 85764, Neuherberg, Alemania

Estos autores contribuyeron igualmente: Bettina Weigel, Jana F. Tegethoff.

Grupo de modelado de enfermedades e ingeniería del destino celular, Centro Alemán de Investigación del Cáncer (DKFZ) y Alianza DKFZ-ZMBH, 69120, Heidelberg, Alemania

Bettina Weigel, Jana F. Tegethoff, Sarah D. Grieder, Bryce Lim, Bhuvaneswari Nagarajan, Jule Truberg, Juan M. Adrian-Segarra, Laura K. Schmidt, Janina Kaspar, Eric Poisel, Elisa Heinzelmann, Manu Saraswat, Marleen Christ & Moritz Centro comercial

HITBR Instituto Hector para la Investigación Traslacional del Cerebro gGmbH, 69120, Heidelberg, Alemania

Bettina Weigel, Jana F. Tegethoff, Sarah D. Grieder, Bryce Lim, Bhuvaneswari Nagarajan, Jule Truberg, Juan M. Adrian-Segarra, Laura K. Schmidt, Janina Kaspar, Eric Poisel, Elisa Heinzelmann, Manu Saraswat, Marleen Christ & Moritz Centro comercial

Instituto Central de Salud Mental, Facultad de Medicina de Mannheim, Universidad de Heidelberg, 68159, Mannheim, Alemania

Bettina Weigel, Jana F. Tegethoff, Sarah D. Grieder, Bryce Lim, Bhuvaneswari Nagarajan, Jule Truberg, Juan M. Adrian-Segarra, Laura K. Schmidt, Janina Kaspar, Eric Poisel, Elisa Heinzelmann, Manu Saraswat, Marleen Christ & Moritz Centro comercial

Facultad de Biociencias, Universidad de Heidelberg, 69120, Heidelberg, Alemania

Bettina Weigel, Jana F. Tegethoff, Bryce Lim, Jule Truberg y Manu Saraswat

Departamento de Neurobiología Clínica, Hospital Universitario de Heidelberg y DKFZ, Heidelberg, Alemania

Yu-Chao Liu y Hannah Monyer

División de Proteómica de Células Madre y Cáncer, Centro Alemán de Investigación del Cáncer (DKFZ), 69120, Heidelberg, Alemania

Dimitris Papageorgiou y Jeroen Krijgsveld

Facultad de Medicina, Universidad de Heidelberg, 69120, Heidelberg, Alemania

Dimitris Papageorgiou y Jeroen Krijgsveld

Laboratorio Europeo de Biología Molecular, Unidad de Biología Estructural y Computacional, 69115, Heidelberg, Alemania

Christian Arnold, Ignacio L. Ibarra y Judith B. Zaugg

Grupo de Investigación Chica y Heinz Schaller, Instituto de Anatomía y Biología Celular, Universidad de Heidelberg, 69120, Heidelberg, Alemania

Joaquin Campos & Claudio Acuna

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BW y JFT fueron responsables del diseño, ejecución, análisis y preparación del manuscrito de la investigación. BL, EP, MS, ILI y CAr diseñaron e implementaron el análisis bioinformático. SG realizó la ingeniería de células madre y los experimentos con neuronas inducidas. JT, LKS, MC y JK contribuyeron con el análisis de imágenes y cultura primaria. BN y JK apoyaron estudios de comportamiento. JAS realizó experimentos con células individuales. YCL, JC y CAc realizaron la electrofisiología. DP y JK realizaron la espectrometría de masas. HM, CAc y JZ asesoraron sobre el diseño de la investigación y la preparación del manuscrito. MM diseñó y supervisó la investigación, interpretó los datos y escribió el manuscrito con el aporte de todos los autores.

Correspondencia al centro comercial Moritz.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Weigel, B., Tegethoff, JF, Grieder, SD et al. La haploinsuficiencia de MYT1L en neuronas humanas y ratones causa fenotipos asociados al autismo que pueden revertirse mediante intervención genética y farmacológica. Psiquiatría Mol (2023). https://doi.org/10.1038/s41380-023-01959-7

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Recibido: 24 de marzo de 2022

Revisado: 30 de diciembre de 2022

Aceptado: 11 de enero de 2023

Publicado: 14 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-023-01959-7

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