Recolección de células: volviéndose cultural

Peter Rose de Alfa Laval analiza una de las áreas de crecimiento de la filtración y separación biofarmacéutica: la recolección de células de mamíferos para producir nuevos fármacos y medicinas. El artículo examina los orígenes de la tecnología utilizada en este sector de la industria y considera los desarrollos recientes.

Nosotros, es decir, los mamíferos, estamos compuestos de células. El reflejo que te enfrentas en un espejo puede parecer bastante sólido, pero lo que realmente estás viendo son aproximadamente 10 billones de células divididas en unos 200 tipos diferentes. Estos grupos de células están bastante especializados: los hígados están formados por células hepáticas, los músculos por células musculares especializadas, etc.

Cultivar y recolectar células de mamíferos fuera del cuerpo y en el laboratorio o fábrica para producir nuevos fármacos y medicinas es una de las ramas más interesantes de la industria moderna de las ciencias biológicas. Sin embargo, por muy descabellado que parezca, estos enormes avances en la ciencia médica se remontan a un pollo que fue disecado a finales del siglo XIX; 1885 para ser precisos. Fue entonces cuando Wilhelm Roux logró mantener la placa medular de dicho embrión de pollo en una solución salina caliente durante varios días y estableció así por primera vez el principio del cultivo de tejidos.

Su trabajo fue llevado a varias etapas más allá por científicos de la Facultad de Medicina John Hopkins y la Universidad de Yale durante la primera década del siglo XX. En las décadas de 1940 y 1950, los virus cultivados en cultivos celulares se utilizaron en la fabricación de vacunas. Las vacunas contra la polio que finalmente eliminaron la amenaza de la enfermedad se cultivaron en cultivos celulares de riñones de mono.

Hoy en día, por supuesto, la producción de fármacos basada en cultivos celulares es una de las áreas de la biotecnología de más rápido crecimiento. Su rápido éxito se debe en gran medida al desarrollo paralelo de tecnologías para las tres etapas clave en el crecimiento de los cultivos celulares: fermentación, recolección y purificación.

La recolección se realiza separando el cultivo celular del medio de cultivo y se utilizan varias técnicas para realizar esta delicada operación; centrifugación, microfiltración, filtración en profundidad y filtración a través de membranas de tamaño de poro absoluto. De las diferentes técnicas, la centrifugación es la que más comúnmente se lleva a escala desde el laboratorio hasta los niveles de producción en fábrica.

La centrifugación utiliza la diferencia de densidad entre los sólidos y el fluido circundante y acelera la sedimentación que normalmente ocurriría durante la sedimentación. La mayoría de las aplicaciones industriales utilizan centrífugas de discos para eliminar células y restos celulares del caldo nutritivo. Las centrífugas de discos ofrecen un funcionamiento continuo, lo que hace que su rendimiento sea coherente con el deseo de limitar el tiempo de las operaciones de cosecha.

Naturalmente, no es tan sencillo como parece. Las células de mamíferos son organismos muy frágiles, por lo que, aunque una centrífuga de discos facilita relativamente el trabajo de separación, el truco consiste en hacerlo con un daño mínimo al producto. La aceleración del material alimenticio rico en proteínas tarda una fracción de segundo. Pero aunque la velocidad es esencial, no debe ser a expensas de la destrucción de la membrana de la pared celular, altamente sensible al corte, que liberaría proteínas intracelulares indeseables en el caldo, un proceso conocido como lisis.

Al evitar la lisis adicional durante la aceleración, es posible aumentar la capacidad del separador y al mismo tiempo lograr el resultado de separación requerido. La purificación posterior de las proteínas diana también se simplifica y se puede llevar a cabo utilizando equipos más compactos, generando así importantes ahorros en el proceso. El desafío, entonces, es lograr la máxima eficiencia de separación con una mínima interrupción del producto.

Así como el cultivo celular se ha desarrollado a partir de orígenes relativamente humildes, también lo ha hecho el equipo utilizado para recolectarlo. De hecho, desde las primeras etapas de la ciencia de los cultivos celulares, cuando Alfa Laval trabajó con líderes de la industria en el desarrollo de fermentaciones de cultivos celulares a gran escala, pronto se hizo evidente que las características de los cultivos celulares exigían diseños de separadores extremadamente suaves. A lo que recurrieron fue al husillo hueco, que tuvo su origen en conceptos desarrollados originalmente para la industria láctea, en los que se utilizaba un tacto suave para evitar que las partículas de grasa de la leche se separaran durante la aceleración. Décadas más tarde, la misma tecnología es la piedra angular del procesamiento moderno de cultivos celulares.

Como muchas innovaciones, el impulso inicial tuvo poco que ver con el resultado final. Cuando los ingenieros de Alfa Laval decidieron inicialmente estudiar la viabilidad de un separador que proporcionara descarga de líquido bajo presión, lo que tenían en mente era cerveza, no leche. El objetivo era purificar la cerveza separándola sin que entrara aire y bajo suficiente presión para evitar la pérdida de dióxido de carbono.

La única forma racional de conseguir un sistema cerrado era alimentar el líquido al recipiente desde abajo, a través de un husillo tubular del recipiente, y descargarlo por el cuello del recipiente. Se construyó una máquina experimental para clarificar cerveza, pero también se probó con leche, ya que se consideró que la máquina podría resolver el problema de la espuma de leche: y así fue.

El proceso de la leche parecía entonces ser el más viable comercialmente. Los ingenieros modificaron la máquina original para proporcionar dos salidas y poder utilizarla también como separadora de nata. Las pruebas en una lechería sueca tuvieron tanto éxito que Alfa Laval produjo varios de los nuevos separadores para exhibirlos en la exposición Deutche Landwirt-schaftlische Gesellschaft de 1933 en Berlín. Este primer separador hermético cambió radicalmente a partir de ese momento la tecnología láctea y cervecera.

Como corresponde a un equipo radicalmente diferente, el separador hermético de husillo hueco presentaba un aspecto completamente diferente a las centrífugas anteriores. El marco fue diseñado de manera que las entradas para leche entera en la parte inferior de la máquina fueran fácilmente accesibles.

No se pudo utilizar ni el husillo tradicional de dos piezas ni el nuevo husillo tipo Báltico. En consecuencia, el separador hermético tuvo que incorporar un diseño de eje completamente nuevo. La solución fue adaptar el husillo del separador de levadura más grande de Alfa Laval en aquel momento, el OVK 5.

En el extremo superior del husillo, justo debajo del cuenco, el cojinete superior flexible (un rodamiento de bolas radial) soportaba el peso del cuenco, y en el extremo inferior, un rodamiento de bolas esférico permitía el movimiento de precisión del husillo. Se introdujo leche entera bajo presión a través del eje hasta el fondo del recipiente. La junta entre el tubo de entrada estacionario y el eje giratorio consistía en una junta de goma en forma de U reforzada con tela. La leche entraba al recipiente a través de la cámara central situada en el fondo, desde donde se distribuía de la forma habitual en la pila de discos.

Al no tener un agujero en el centro su diámetro se reducía considerablemente en comparación con las máquinas con avance superior. Gracias al diseño general, todo el espacio libre del recipiente se llenó de líquido.

Además de lograr el objetivo principal (crema y leche desnatada sin espuma), el separador hermético proporcionó varias otras ventajas; el más importante de los cuales era su capacidad de desnatado limpio, mejor que cualquier otro separador. Dos factores contribuyeron a este mejor nivel de desempeño. En primer lugar, la leche se aceleró muy suavemente en el largo huso hueco, minimizando la división de los glóbulos de grasa. En segundo lugar, a los discos Alfa se les dio un radio interior más pequeño, aumentando el área de separación disponible en un volumen de cuenco determinado.

El mismo diseño hermético de husillo hueco es fundamental para Culturefuge, que fue la primera centrífuga de cultivo celular totalmente hermética del mundo, desarrollada principalmente para aplicaciones que involucran cultivos de células de mamíferos y proteínas precipitadas. Su uso estaba destinado a proporcionar la aceleración más suave posible en un separador de pilas de discos centrífugos diseñado específicamente para la recolección de cultivos celulares.

La suave aceleración impone tensiones de corte mínimas sobre las células. Igual de importante es que el eje hueco crea un diseño verdaderamente hermético que elimina por completo las interfaces aire-líquido dentro de la centrífuga y, por lo tanto, también elimina la formación de espuma, una de las principales causas de la degradación de proteínas.

Como beneficio adicional, el diseño también permite la descarga centralizada en un radio pequeño, lo que reduce el consumo de energía y mantiene la temperatura elevada al mínimo durante la separación.

En un modelo matemático para la rotura de la zona de alimentación de partículas sensibles al corte en separadores centrífugos, se encontró que la rotura era independiente del caudal. Un estudio de Boychyn et al. Simuló el campo de flujo en la zona de aceleración de una centrífuga tradicional, utilizando dinámica de fluidos computacional (CFD). En este estudio se compararon dos casos, uno clásico con aire presente en la zona de alimentación y otro lleno suavemente de líquido, es decir, sin aire.

Esta técnica de modelado confirmó que, durante la aceleración con aire presente, la tasa máxima de disipación de energía es hasta dos veces mayor que en la aceleración sin aire.

Una mayor disipación de energía conduce a una rotura de partículas considerablemente mayor en la suspensión de precipitado de proteínas y, por tanto, a una clarificación menos exitosa. Un estudio posterior de Boychyn utilizó una herramienta CFD similar para modelar las fuerzas de aceleración en la zona de aceleración de un cuenco de múltiples cámaras. En este estudio, el grupo pudo hacer predicciones precisas sobre el rendimiento de la centrífuga.

Finalmente, existe un estudio comparativo realizado por el mismo grupo de investigación sobre el cultivo celular procesado en dos centrífugas de discos de pequeña producción/escala piloto. Un separador tenía una zona de aceleración clásica sin relleno y el otro una entrada hermética de husillo hueco para acelerar suavemente la alimentación. En todos los demás aspectos importantes (área equivalente, rpm, etc.), las máquinas eran idénticas. El grupo descubrió que una centrífuga de tipo huso hueco proporcionaba un aumento de 2,5 veces en el rendimiento para el mismo rendimiento de clarificación en comparación con el otro separador.

Traducido a un sistema moderno de recolección de cultivos celulares como el Culturefuge, esta tecnología de huso hueco hizo posible proporcionar un método de recolección continua de células, en condiciones herméticas. El Culturefuge montado sobre patines consta de un separador de alta velocidad con pila de discos y tuberías para líquidos de servicio y líquidos de proceso. Incluye un sistema eléctrico integrado con arrancador, control PLC y unidad neumática. Un motor con un VFD integrado es estándar. Como opción, el sistema también puede incluir una bomba esterilizable por vapor para el transporte de la fase sólida. El diseño de Culturefuge cumple con la mayoría de las principales especificaciones de recipientes a presión, incluidas ASME y PED.

Todas las piezas en contacto con el producto están hechas de acero inoxidable de alta calidad. Hay disponibles varios grados de acabado superficial: 1,2 μm Ra, 0,8 μm Ra o 0,5 μm Ra con electropulido. El diseño modular montado sobre patines se puede entregar para funcionamiento abierto, funcionamiento contenido, funcionamiento aséptico esterilizable con vapor o funcionamiento únicamente con descontaminación con vapor.

El material de alimentación ingresa al Culturefuge 100 a través de una entrada de alimentación de husillo hueco y se acelera gradualmente a medida que se mueve hacia arriba, minimizando así las fuerzas de corte sobre los líquidos y previniendo la lisis celular. Para evitar el riesgo de que se mezcle con el aire, la zona de alimentación está completamente llena de líquido giratorio. La provisión de esta salida completamente hermética elimina la posibilidad de que los materiales entren en contacto con el aire o el ambiente externo; evitando así la formación de espuma y la desnaturalización del producto.

Durante la producción normal, el agua de funcionamiento mantiene el fondo deslizante del recipiente cerrado contra la tapa del recipiente. Durante la descarga, el fondo del recipiente deslizante desciende durante un breve período (menos de un segundo) y los sólidos se expulsan a través de los puertos de descarga. La alta velocidad de los sólidos expulsados ​​se reduce en el ciclón.

La recolección de células para desarrollar nuevas vacunas y medicamentos ha pasado del ámbito de la ciencia ficción al hecho, en parte gracias a una rebanada de pollo y un separador que comenzó su vida desnatando la leche de la crema y ahora ayuda a cosechar el bien más preciado de todos: la buena salud. .